论文部分内容阅读
单因素干预模式治疗血管内膜增生的疗效不佳,联合治疗是发展趋势。白细胞介素(interleukin,IL)-10和γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)在一定条件下都可以抑制血管平滑肌细胞增殖,但IL-10在体内抑制IFN-γ的产生,削弱IFN-γ的作用,因此设想应用IL-10时补充外源性IFN-γ。商品化的IL-10重组蛋白制剂,体内应用时血浆半衰期短,疗效差;重组腺病毒载体介导给药时,IL-10的作用时间明显延长,疗效优于重组蛋白制剂。因此,本研究构建IL-10的重组腺病毒载体,以腺病毒介导方式给药,观察体外实验的效果。本课题包括三部分:①获取目的基因,即从从体外培养的外周血单个核细胞获取IL-10cDNA,为重组载体构建做准备;②构建IL-10的重组腺病毒载体;③腺病毒介导IL-10基因转染体外培养的人脐带动脉平滑肌细胞,同时于培养液中加入终浓度为200~u/ml的IFN-γ,观察基因转染联合应用相关药物对血管平滑肌细胞增殖的作用,并初步研究相关机制,旨在探索有意义的联合基因治疗方案,提高发生发展机制极为复杂的血管内膜增生性疾病的治疗效果。 第一部分 从体外培养的外周血单个核细胞克隆人白细胞介素-10cDNA 目的:从体外培养的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)克隆人白细胞介素(human interleukin, hIL)-10cDNA,为亚克隆及基因治疗研究奠定基础。方法:淋巴细胞分离液自外周静脉血中分离出PBMCs,含刀豆蛋白A(concanavalin A, conA)的RPMI 1640培养液培养24小时,提取总RNA,逆转录聚合酶链反应(Reverse transcriptase-polymerase chain reaction, RT-PCR)扩增hIL-10cDNA,克隆入pUCm-T载体,转化感受态细胞DH5α,蓝白筛选,PCR及Pvu I、Not I双酶切鉴定,重组DNA测序。结果:RT-PCR扩增产物560bp,与预期片段大小一致,随机挑取白色菌落,小量提取的质粒经PCR、限制性内切酶酶切鉴定,目的条带与预期片段的大小均一致,测序结果与Genebank公布的hIL-10cDNA序列完全一致。结论:从PBMC中扩增hIL-10cDNA,克隆至pUCm-T载体,方法较为简便,为进一步进行亚克隆及表达研究提供了可靠的