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研究目的肾细胞癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤,其发病率长期处于增长态势。2018年全球肾癌新发病例约40万,死亡病例约17万;在中国肾癌新发病例约7万,死亡病例约4.3万。肾癌患者中约有30%初诊时已发生转移,还有约25%局限性肾癌患者术后会出现局部复发或远处转移,转移部位以肺部最为常见。目前转移性肾癌患者的治疗手段仍然有限,预后亦较差,肾癌发生远处转移的分子生物学机制仍不清楚。近来研究表明肿瘤细胞来源的外泌体能通过介导转移前微环境形成,从而在肿瘤转移过程中发挥着重要作用,但是肾癌细胞外泌体是否能够通过介导肺转移前微环境形成进而影响肾癌肺转移过程,相关分子机制如何,目前仍有待阐明。本研究拟探讨肾癌细胞外泌体在肾癌肺转移过程中的功能以及相关分子机制,为肾癌肺转移患者寻找新的潜在诊断标志物以及干预靶点提供理论依据。研究方法1.采用超速离心方法提取低转移性肾癌细胞786-O和高转移性肾癌细胞SN12-PM6来源的外泌体,标记为786-O-exo和SN12-PM6-exo,利用NTA(nanoparticle tracking analysis)、透射电镜以及蛋白免疫印迹等方法对外泌体进行鉴定分析。用荧光染料标记外泌体后在体内和体外开展外泌体摄取追踪实验,探索肾癌细胞外泌体在肺部的受体细胞类型。2.发现肺成纤维细胞为外泌体在肺部的主要受体细胞后,通过免疫组化检测肾癌肺转移灶中成纤维细胞激活标志物a-SMA的表达情况,验证肺转移灶中是否存在被激活的肺成纤维细胞。用786-O-exo和SN12-PM6-exo分别培育人肺成纤维细胞MRC-5,检测MRC-5细胞迁移能力以及IL-1β和IL-8等炎症因子表达水平的变化,验证外泌体是否参与肺成纤维细胞的激活过程。3.发现肾癌细胞外泌体能介导肺成纤维细胞的激活后,利用动物活体成像系统和肺组织H&E染色切片比较经过786-O-exo或SN12-PM6-exo培育后的小鼠肾癌肺转移灶的形成情况,验证外泌体是否能通过介导肺成纤维细胞激活影响肾癌肺转移过程。4.利用miRNAs芯片检测SN12-PM6-exo和786-O-exo并分析其中差异表达的miRNAs,将SN12-PM6-exo中高表达的miRNAs分别转入MRC-5细胞,通过RT-q PCR以及Transwell迁移等实验筛选其中能够激活肺成纤维细胞的miRNAs。5.发现外泌体中miR-6826-5p能介导肺成纤维细胞的激活后,选择miR-6826-5p作为研究对象。应用si RNA干扰外泌体转运蛋白HRS的表达水平,验证HRS的表达水平与外泌体中miR-6826-5p含量的关系。检测MRC-5细胞经过外泌体培育后的miR-6826-5p表达水平的变化,并应用荧光共定位实验证明外泌体传递miR-6826-5p至肺成纤维细胞的过程。6.应用慢病毒转染肾癌细胞的方法获得miR-6826-5p过表达的外泌体,通过体内、外实验验证外泌体miR-6826-5p过表达对外泌体介导肺成纤维细胞激活以及发挥促进肾癌肺转移功能的影响。7.利用生物信息工具Target Scan预测以及通路富集分析等方法筛选miR-6826-5p的下游功能靶基因,进行miRNA pull down以及双荧光素酶报告实验找出与miR-6826-5p结合的靶基因,发现miR-6826-5p能够与靶基因TANK结合后,利用rescue方法验证miR-6826-5p对靶基因TANK的调控作用。8.进行Ed U以及Transwell迁移实验证明肺成纤维细胞激活后对肾癌细胞增殖和迁移能力的影响,在体内通过皮下荷瘤以及肺转移裸鼠模型验证肺成纤维细胞激活后对肾癌细胞在皮下成瘤以及在肺部定植转移的影响。9.为了探索miR-6826-5p的临床应用价值,收集局限性肾癌以及转移性肾癌(含肺转移)患者的肿瘤组织和血清标本,检测肾癌组织以及血清外泌体样本中的miR-6826-5p表达水平,分析miR-6826-5p表达水平的高低与肾癌发生肺转移的相关性。结果1.提取的肾癌细胞外泌体786-O-exo和SN12-PM6-exo均符合外泌体的基本大小形态特征,外泌体摄取实验结果发现肺肾癌细胞外泌体进入肺部后被肺成纤维细胞摄取。2.肾癌肺转移灶中存在被激活的肺成纤维细胞,肾癌细胞外泌体培育MRC-5细胞后能提高其迁移能力以及IL-1β、IL-8和TGF-β等促炎促癌细胞因子的表达水平,提示肾癌细胞外泌体能够介导肺成纤维细胞激活,并且SN12-PM6-exo的激活能力强于786-O-exo。3.相对于对照组小鼠,经过肾癌细胞外泌体培育后的小鼠肾癌肺转移灶明显较多,而且SN12-PM6-exo组小鼠的肾癌肺转移灶多于786-O-exo组。4.根据外泌体miRNAs芯片的检测结果,分析并筛选出9条在SN12-PM6-exo中高表达的miRNAs(上调倍数大于4且平均标准化信号值>5),其中只有miR-6826-5p能明显提高肺成纤维细胞的迁移能力以及IL-1β和IL-8等细胞因子的表达水平。5.干扰肾癌细胞中HRS的表达后,外泌体中miR-6826-5p的含量也同样下调,说明HRS可能参与调控外泌体中miR-6826-5p的转运。MRC-5细胞经过外泌体培育后miR-6826-5p的表达水平明显增加,并且共定位实验证明了外泌体将miR-6826-5p传递至肺成纤维细胞的过程。6.肾癌细胞外泌体miR-6826-5p过表达后会导致外泌体介导肺成纤维细胞激活以及促进肾癌肺转移的功能增强。7.Mi R-6826-5p能与靶基因TANK结合,Rescue实验发现miR-6826-5p通过抑制靶基因TANK的表达水平以介导NF-κB信号通路激活,而TANK基因过表达可以逆转miR-6826-5p的调控作用。8.肺成纤维细胞激活后可以促进肾癌细胞的体外增殖和迁移能力,在体内可以增强肾癌细胞的成瘤和肺转移能力。9.临床研究发现肾癌组织中miR-6826-5p高表达与肾癌发生恶性进展以及较差的预后呈正相关关系,而且肾癌患者血清外泌体中miR-6826-5p高表达与肾癌发生肺转移同样呈正相关关系。结论肾癌细胞外泌体进入肺部后被肺成纤维细胞摄取,在摄取过程中肾癌细胞外泌体将miR-6826-5p传递至肺成纤维细胞,然后miR-6826-5p通过调控靶基因TANK及其下游NF-κB信号通路将肺成纤维细胞激活为肿瘤相关性的成纤维细胞,促进其表达IL-1β和IL-8等炎症细胞因子,最终介导肺转移前微环境形成并促进肾癌细胞在肺部定植转移。此外,临床研究发现肾癌患者血清外泌体中的miR-6826-5p高表达可能与肾癌肺转移的发生呈正相关关系。因此,本研究表明miR-6826-5p及其下游分子在肾癌肺转移过程中发挥重要作用,具有作为肾癌肺转移患者的诊断标志物以及治疗靶点的潜能。