论文部分内容阅读
背景偏头痛是一种严重、具有致残性的神经功能障碍。其发病率与致残率呈逐年上升趋势,影响全世界约15%的人口,其中女性发病率高于男性,为患者以及社会均带来沉重负担。目前偏头痛发病机制尚不明确,缺乏有效治疗方法,约1/2偏头痛患者经治疗后未能取得满意效果。因此对偏头痛发病机制的研究具有重大意义。近年研究发现,神经源性炎症及神经炎症参与偏头痛发病及偏头痛慢性化。三叉神经血管系统激活后释放降钙素基因相关肽（CGRP）诱导血管通透性增加、血脑屏障破坏、白细胞浸润、胶质细胞活化和炎症介质产生,放大中枢炎症级联反应,在偏头痛的发病中发挥关键作用。胶质细胞活化在疼痛发生中发挥重要作用,其中以小胶质细胞和星形胶质细胞激活为主,但胶质细胞对偏头痛发病的影响及其具体机制尚不明确。白细胞介素是一类重要的炎性细胞因子。胶质细胞是中枢神经系统（CNS）白细胞介素（IL）的主要来源。CNS胶质细胞彼此靠近,相互激活。炎性介质或神经递质与其受体的相互作用是胶质细胞间相互交流的重要途径。IL-18属于IL-1家族成员,在炎性和免疫反应中发挥关键作用。IL-18主要表达于激活的小胶质细胞,而其受体IL-18R表达于星形胶质细胞。随着对IL-18生物学特性及功能的进一步阐明,其在疼痛发生中发挥的作用也逐渐被认识。另外,在偏头痛患者头痛发作期,血浆中多种炎症细胞因子表达水平显著上调,如肿瘤坏死因子（TNF）、IL-1β和IL-6等,因此炎症细胞因子在偏头痛病理生理机制中可能发挥重要作用。而偏头痛患者外周血IL-18表达水平如何?IL-18/IL-18R信号通路是否参与偏头痛发病?IL-18/IL-18R信号通路介导的胶质细胞相互作用是否与偏头痛发生相关?IL-18通路或为偏头痛治疗新靶点?目前尚无研究报道。Toll-样受体4（TLR4）/丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路参与小胶质细胞激活释放IL-18,而核转录因子-κB（NF-κB）信号通路与星形胶质细胞激活有关。神经损伤条件下,TLR4/p38 MAPK信号通路激活诱导小胶质细胞活化释放IL-18。IL-18以旁分泌的形式作用于IL-18R,进一步激活NF-κB信号通路,从而诱导星形细胞活化参与神经病理性疼痛的发生。越来越多的证明表明TLR4、MAPK和NF-κB在偏头痛发病中占据重要地位。但是其与IL-18/IL-18R信号通路如何作用参与偏头痛的发生?目前尚无研究报道。CNS谷氨酸稳态的维持,主要依赖兴奋性氨基酸转运蛋白2（EAAT2）。EAAT2功能失调导致谷氨酸在突触间隙中异常聚集,并持续作用于神经元N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）,诱导c-fos高表达即神经元异常激活,从而诱发中枢敏化。中枢敏化被认为是偏头痛的重要发病机制之一。IL-18/IL-18R信号通路可调控NMDAR的表达参与神经病理性疼痛的发生。而EAAT2功能失调是否参与发作性偏头痛发生?IL-18/IL-18R信号通路是否调控谷氨酸信号通路参与偏头痛发生?目前尚无研究报道。延髓背角为中枢头痛信号调控的关键部位。本实验旨在研究延髓背角IL-18/IL-18R信号通路介导胶质细胞相互作用对偏头痛发病的影响,并进一步探讨确切分子机制,为偏头痛发病机制的阐明提供新思路;同时采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测外周血IL-18和IL-18结合蛋白（IL-18BP）的表达变化,为偏头痛外周生物标志物的寻找提供新方向。目的（1）观察IL-18/IL-18R信号通路在偏头痛大鼠模型中的激活以及干预IL-18/IL-18R信号通路对偏头痛发病的影响。（2）阐明IL-18/IL-18R信号通路在偏头痛大鼠模型中介导胶质细胞相互作用及其参与偏头痛发病的分子机制。（3）初步探讨偏头痛患者外周血IL-18和IL-18BP表达水平变化。方法（1）动物模型构建及检测:构建炎性汤硬脑膜刺激模型（简称偏头痛大鼠模型）模拟偏头痛发作。模型建立后,进行头痛行为学评估以及c-fos和CGRP表达检测。头痛行为学包括大鼠挠头次数和头面部机械刺激痛阈值。（2）胶质细胞激活检测:免疫荧光和Western-blot检测星形胶质细胞激活标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和小胶质细胞激活标志物离子钙结合衔接分子1（Iba1）的表达。（3）IL-18、IL-18R、EAAT2和NMDAR表达变化检测:实时荧光定量聚合酶式反应（RT-q PCR）和Western-blot检测IL-18和IL-18R表达;免疫荧光检测IL-18和IL-18R在胶质细胞中的表达定位;Western-blot检测EAAT2、N-甲基-D-天冬氨酸受体（NR）亚基1（NR1）、NR2A和NR2B的表达;免疫荧光检测EAAT2和NMDAR的表达定位。（4）干预TLR4信号通路及相关检测:TLR4特异性拮抗剂TAK-242阻断TLR4通路,随后Western-blot检测IL-18表达的变化;免疫荧光检测p-p38（p38MAPK磷酸化形式）的入核及p-p38与IL-18的共表达。（5）干预IL-18/IL-18R信号通路及相关检测:抗IL-18中和抗体阻断IL-18通路,观察大鼠头痛行为学;Western-blot检测c-fos、CGRP、GFAP、p-p65（NF-κB磷酸化形式）、EAAT2、NR1、NR2A和NR2B表达;免疫荧光检测p-p65与IL-18R的共表达;IL-18硬脑膜给药,观察头痛行为学,随后免疫荧光和Western-blot检测胶质细胞激活;Western-blot检测EAAT2、NR1、NR2A和NR2B的表达。（6）外周血IL-18和IL-18BP的检测:同期招募偏头痛患者10例和健康对照8例,抽取肘静脉血并分离血清,ELISA检测IL-18和IL-18BP表达水平。结果（1）偏头痛大鼠模型造模成功:挠头次数显著增多,头面部机械刺激痛阈值显著下降（P＜0.05）;c-fos和CGRP表达水平显著上调（P＜0.05）。（2）胶质细胞和IL-18/IL-18R信号通路发生激活:Iba1和GFAP免疫荧光显示小胶质细胞和星形胶质细胞发生激活（P＜0.05）;RT-q PCR和Western-blot显示偏头痛大鼠模型IL-18、IL-18R表达水平显著上调（P＜0.05）。（3）IL-18/IL-18R信号通路正调控头痛行为:IL-18硬脑膜给药后,可诱发大鼠头痛行为;抗IL-18中和抗体阻断IL-18/IL-18R信号通路后,显著缓解大鼠头痛行为（P＜0.05）,并显著抑制偏头痛大鼠模型c-fos和CGRP的激活（P＜0.05）。（4）IL-18/IL-18R信号通路介导胶质细胞相互作用:免疫荧光双标显示IL-18表达于小胶质细胞,IL-18R表达于星形胶质细胞;IL-18硬脑膜给药诱导胶质细胞激活（P＜0.05）;阻断IL-18/IL-18R信号通路显著抑制星形胶质细胞的激活（P＜0.05）;TAK-242阻断TLR4信号通路后,显著抑制了IL-18的表达上调;免疫荧光双标显示p-p38入核并与IL-18共表达;Western-blot显示p-p65表达水平显著上调（P＜0.05）;阻断IL-18/IL-18R信号通路后,显著抑制了p-p65的表达上调（P＜0.05）;免疫荧光双标显示p-p65与IL-18R共表达。（5）IL-18/IL-18R信号通路调控EAAT2和NMDAR的表达:在偏头痛大鼠模型,Western-blot显示EAAT2表达水平显著下调（P＜0.05）,NR1、NR2A和NR2B表达水平显著上调（P＜0.05）;免疫荧光双标显示,EAAT2大量表达于星形胶质细胞,NMDAR表达于神经元。阻断IL-18/IL-18R信号通路显著抑制星形胶质细胞EAAT2表达下调及神经元谷氨酸受体表达上调（P＜0.05）;激活IL-18/IL-18R信号通路可诱导星形胶质细胞EAAT2表达下调及神经元谷氨酸受体表达上调（P＜0.05）。（6）外周血IL-18和IL-18BP表达水平:ELISA显示偏头痛患者发作间期外周血IL-18和IL-18BP表达水平与健康对照无显著差异。结论（1）IL-18/IL-18R信号通路参与偏头痛发病;激活该信号通路诱发大鼠头痛行为,而阻断该信号通路可缓解头痛行为——IL-18/IL-18R信号通路或为偏头痛治疗的新靶点。（2）IL-18/IL-18R信号通路介导胶质细胞相互作用而参与偏头痛发生;小胶质细胞激活释放IL-18依赖TLR4/p38 MAPK信号通路;而小胶质细胞来源的IL-18作用于IL-18R,进而激活NF-κB信号通路参与星形胶质细胞活化。（3）星形胶质细胞激活后EAAT2表达下调,造成突触间隙内谷氨酸过度堆积;异常聚集的谷氨酸过度激活神经元NMDAR,诱发神经元高兴奋性及中枢敏化形成,从而导致偏头痛的发生。（4）外周血IL-18和IL-18BP在偏头痛中的临床意义需要扩大样本量进行更深入探讨。