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食管癌按照病理类型不同一般可分为食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cancer,ESCC）和食管腺癌（esophagus adenocarcinoma,EAC）。作为全球最常见的癌症之一,食管癌在所有癌症中发病率高居第七位,死亡率高居第六位。我国更是食管癌大国,且呈现地域性分布的特点,不同地区食管癌的发病率差异很大。在我国,食管鳞状细胞癌占食管癌的95%以上,是资源贫乏、经济不发达国家地区中最常见的组织学类型。河北省磁县被确定为世界上食管鳞状细胞癌患者高危地区之一。由于缺乏有效的临床诊断方法,食管鳞状细胞癌通常在较晚期才被诊断出来。食管鳞状细胞癌的5年总生存率仅为20%左右。食管鳞状细胞癌的预后受多种因素影响,包括病理分期和治疗方法。但是,还有诸多因素的影响尚未得到充分探讨。急需补充新的参考标记物以便更准确地预测患者预后并为其提供最佳的诊疗决策。为了进一步探讨和改善食管鳞状细胞癌患者的生存前景,本研究探讨了micro RNA（miRNA）对该恶性肿瘤的基因表达的影响。在结构上看,miRNA是一种内源性保守的小型非编码RNA,其长度约为20～25个核苷酸。在其功能上看,miRNA通过与靶mRNA的3’-UTR结合作为转录后调节因子来对基因表达进行负调控,这通常会导致基因沉默。越来越多的证据表明,由于其在癌症中的异常表达水平,miRNA可被用作合适的新的恶性肿瘤预后标志物。研究报告称,Micro RNA-25（miR-25）在食管鳞状细胞癌组织中表达水平升高,并通过调节E-钙粘着蛋（E-Cadherin）或FBXW7信号转导与肿瘤淋巴结转移（tumor lymph node metastasis,TNM）阶段和上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）相关。研究证实B细胞易位基因2（B cell translocation gene 2,BTG2）是重要的肿瘤抑制基因和放射敏感基因p53的下游靶点,并在各种组织和器官中作为一种短暂的早期反应蛋白表达,并广泛参与多种生物细胞分化、增殖和凋亡等活动。研究发现食管鳞状细胞癌患者BTG2的表达水平明显低于健康人。并且BTG2水平是影响ESCC患者预后的独立危险因素。BTG2的下调可以作为一种分子标记来识别和预测ESCC的进展和判断辐射敏感度。然而,ESCC是一个全身性多基因疾病,BTG2在ESCC中确切的作用尚不清楚,需要进一步通过研究阐明。综上所述,miR-25和BTG2在食管鳞状细胞癌的进展中发挥作用的机制尚未得到充分探索证实。本研究旨在探索证实食管鳞状细胞癌肿瘤组织中miR-25是否靶向调控BTG2的表达来促进食管鳞状细胞癌的增殖和转移。以期它们能够作为ESCC患者极具预后判断和临床治疗指导能力的生物标志物。第一部分miR-25和BTG2通过调控Vimentin和E-Cadherin的表达对食管鳞状细胞癌增殖和转移的影响目的:研究发现miR-25在食管鳞状细胞癌组织中表达水平升高,并通过调节E-Cadherin或FBXW7信号转导与淋巴结转移、肿瘤淋巴结转移（TNM）阶段和上皮间质转化（EMT）相关。既往研究表明Vimentin和E-cadherin是促进肿瘤转移的EMT的关键参与者。而在食管鳞状细胞癌组织中BTG2的表达水平明显低于健康人,并且BTG2表达水平是影响ESCC患者预后的独立危险因素。本研究部分主要探讨miR-25/BTG2对食管鳞状细胞癌细胞系的转移与增殖的影响。并证实miR-25通过miR-25/BTG2调节Vimentin和E-Cadherin的表达水平以及Vimentin和E-Cadherin属于BTG2蛋白的下游蛋白的推测。方法:1.体外培养食管鳞状细胞癌细胞系ECA109和KYSE150至对数生长期。2.使用qRT-PCR方法检测miR-25在ECA109和KYSE150两种食管鳞状细胞癌细胞系中的表达水平。3.使用慢病毒转染方法在食管鳞状细胞癌细胞系中建立稳定下调的miR-25细胞株（miR-25 KD）,并使用qRT-PCR方法验证miR-25被下调。4.使用Western Blot方法检测ECA109和KYSE150两种食管鳞状细胞癌细胞系和稳定的miR-25 KD细胞系（敲低miR-25后ECA109和KYSE150细胞系）中BTG2、E-Cadherin和Vimentin的表达水平。5.使用CCK-8实验方法来检测食管鳞状细胞癌细胞系ECA109/KYSE150和稳定的miR-25KD细胞系的增殖水平。6.使用transwell实验方法检测食管鳞状细胞癌细胞系ECA109/KYSE150和稳定的miR-25KD细胞系的转移水平。结果:1.多种食管鳞状细胞癌细胞系中miR-25的高表达;miR-25在食管鳞状细胞癌细胞系中的表达水平对食管鳞状细胞癌细胞的增殖的影响多种食管鳞状细胞癌细胞系中miR-25的表达水平显著高于NE1（对照细胞系）;在ECA109和KYSE150中,miR-25下调后（即miR-25KD细胞系）的细胞增殖能力均出现显著下降。2.miR-25在食管鳞状细胞癌细胞系中的表达水平对食管鳞状细胞癌细胞的转移的影响在ECA109和KYSE150中,miR-25下调后（即miR-25KD细胞系）的细胞转移能力均出现显著下降。3.miR-25在食管鳞状细胞癌中对BTG2/E-Cadherin/Vimentin表达的影响敲低miR-25（即miR-25KD细胞系）后,Vimentin的表达水平急剧下调,而E-Cadherin和BTG2的表达水平却大大增加。小结:多种食管鳞状细胞癌细胞系中miR-25的表达水平显著较高;miR-25的高水平与食管鳞状细胞癌的增殖转移呈密切正相关,调低miR-25表达可抑制食管鳞状细胞癌细胞的增殖和转移;miR-25可调控增加Vimentin的表达并抑制E-Cadherin的表达。第二部分miR-25通过靶向负调控BTG2的表达对食管鳞状细胞癌增殖和转移的影响目的:作为第一个在BTG/TOB基因家族中发现的基因,BTG2参与了癌细胞的许多生物活动,并在抑制癌症中发挥了作用。BTG2通过几个重要的信号通路调节细胞增殖、转移和凋亡,并且可能成为肿瘤抑制因子中的一颗冉冉升起的新星。通过搜索数据库“Target Scan”和“miRanda”,发现miR-25与BTG2 mRNA 3’UTR（图5A）在序列方面匹配。因此我们推测BTG2作为miR-25的直接靶点发挥作用,BTG2的表达直接受miR-25水平的调节。本实验部分主要验证miR-25与BTG2的靶向关系。以期miR-25和BTG2作为联合标志物在食管鳞状细胞癌中发挥更好的作用。方法:1.在ECA109和KYSE150细胞系内进行与具有BTG2 mRNA 3’UTR的荧光素酶报告质粒和miR-25模拟物质粒共转染并进行验证。2.荧光素酶活性分析:在质粒共转染48 h后使用荧光素酶测定仪检测各组细胞的荧光强度。3.数据分析:将三次平行试验得到的数据进行分析。4.体外培养食管鳞状细胞癌细胞系ECA109和KYSE150至对数生长期。5.使用慢病毒转染方法在食管鳞状细胞癌细胞系中建立稳定下调的miR-25细胞株（miR-25 KD）,并使用qRT-PCR方法验证miR-25被下调。6.在miR-25KD细胞系中下调BTG2（BTG2-si RNA转染）。7.使用CCK-8实验方法来检测食管鳞状细胞癌细胞系ECA109/KYSE150,稳定的miR-25KD细胞系和miR-25KD+si-BTG2细胞系的增殖水平。8.使用transwell实验方法检测食管鳞状细胞癌细胞系ECA109/KYSE150,稳定的miR-25KD细胞系和miR-25KD+si-BTG2细胞系的转移水平。9.使用Western Blot方法检测ECA109和KYSE150两种食管鳞状细胞癌细胞系、稳定的miR-25 KD细胞系（敲低miR-25后ECA109和KYSE150细胞系）和和miR-25KD+si-BTG2细胞系中BTG2、E-Cadherin和Vimentin的表达水平。结果:1.miR-25在食管鳞状细胞癌细胞系中的表达水平对食管鳞状细胞癌细胞的增殖的影响是通过BTG2实现的食管鳞状细胞癌细胞系中miR-25的表达水平显著高于NE1（对照细胞系）;在ECA109和KYSE150中,miR-25下调后（即miR-25KD细胞系）的细胞增殖能力均出现显著下降。而转染了针对BTG2的si RNA（敲低）的miR-25KD细胞系的增殖能力则得以恢复。2.miR-25在食管鳞状细胞癌细胞系中的表达水平对食管鳞状细胞癌细胞的转移的影响是通过BTG2实现的在ECA109和KYSE150中,miR-25下调后（即miR-25KD细胞系）的细胞转移能力均出现显著下降。而转染了针对BTG2的si RNA（敲低）的miR-25KD细胞系的转移能力得以恢复。3.miR-25在食管鳞状细胞癌中对BTG2/E-Cadherin/Vimentin表达的影响是通过BTG2实现的敲低miR-25（即miR-25KD细胞系）后,Vimentin的表达水平急剧下调,而E-Cadherin和BTG2的表达水平却大大增加。转染了针对BTG2的si RNA（敲低）的miR-25KD细胞系中发现Vimentin和E-cadherin的表达水平得到恢复。Vimentin和E-cadherin属于BTG2蛋白的下游蛋白。4.BTG2作为miR-25的直接靶点发挥作用miR-25与BTG2 mRNA 3’UTR特异性结合下调了荧光素酶的活性。同时,没有miR-25结合位点的突变构建体的荧光素酶活性不受miR-25模拟物质粒的影响。小结:BTG2作为miR-25的直接靶点发挥作用,BTG2的表达直接受miR-25水平的调节。第三部分miR-25和BTG2对食管鳞状细胞癌患者预后的影响目的:完美的肿瘤标志物一般具有灵敏度高、特异性好的特点,完美标志物的检测方法可用于准确检测早期癌症患者或反映癌症的进展。为了能够将miR-25和BTG2作为联合标记物应用于临床。本实验部分主要观察miR-25和BTG2与食管鳞状细胞癌患者生存预后的关联性。方法:1.收集来河北医科大学第四医院胸外科就诊的56例食管鳞状细胞癌患者的肿瘤标本和完整临床数据,包括肿瘤分期、生存情况随访数据等。2.用qRT-PCR方法检测miR-25在食管鳞状细胞癌和癌旁组织中的表达水平,再根据食管鳞状细胞癌组织与癌旁组织中Micro RNA-25的相对表达水平,将Micro RNA-25表达水平分为两组,比值大于2为高表达组,小于等于2为低表达组。3.使用IHC方法检测BTG2在食管鳞状细胞癌和癌旁组织中的表达水平。并再根据IHC评分,将BTG2表达水平分为阳性和阴性两组,即BTG2表达水平阳性（IHC≥2）和阴性（IHC=0或1）两组。4.使用卡方检验及单变量Kaplan-Meier和COX回归统计学方法分析miR-25和BTG2的表达与食管鳞状细胞癌患者预后的相关性。设定P＜0.05为具有统计学意义。结果:1.食管鳞状细胞癌患者癌组织及癌旁组织中miR-25表达水平及临床意义56对食管鳞状细胞癌患者临床组织样本中癌组织与癌旁组织相比,癌组织中miR-25水平显著高表达。miR-25水平高表达与术后转移呈正相关。单变量Kaplan-Meier分析表明miR-25的表达水平与总生存期（OS）和无转移生存率（MFS）密切相关。2.食管鳞状细胞癌患者癌组织及癌旁组织中BTG2表达水平及临床意义56对食管鳞状细胞癌患者临床组织样本中BTG2在食管鳞状细胞癌组织中的表达显著低于邻近的癌旁组织。BTG2表达水平与术后转移显著相关。单变量Kaplan-Meier分析表明BTG2的表达水平与总生存期（OS）和无转移生存率（MFS）密切相关。3.食管鳞状细胞癌患者中miR-25和BTG2相关性分析及独立预后因素分析。通过比较miR-25和BTG2的表达水平,回归分析发现miR-25的相对表达水平与BTG2呈负相关。单因素分析显示,miR-25和BTG2与性别、年龄、发病部位、TNM分期等特征无显著相关性。多变量分析包括了术后转移情况和miR-25和BTG2的表达水平。结果显示BTG2表达总生存期（OS）和无转移生存率（MFS）密切相关。小结:食管鳞状细胞癌组织中miR-25高表达,BTG2低表达。并且miR-25的表达水平与总生存期（OS）和无转移生存率（MFS）呈负相关。BTG2的表达水平与总生存期（OS）和无转移生存率（MFS）呈正相关。结论:1.多种食管鳞状细胞癌细胞系中miR-25高表达;食管鳞状细胞癌细胞系中miR-25高表达与癌细胞的增殖和转移呈正相关;调低miR-25表达可抑制食管鳞状细胞癌细胞的增殖和转移。2.miR-25可以通过靶向负调控BTG2的表达,来增加Vimentin的表达,并抑制E-Cadherin的表达,实现对食管鳞状细胞癌的增殖和转移的影响;Vimentin和E-cadherin属于BTG2蛋白的下游蛋白。3.BTG2作为miR-25的直接靶点发挥作用,BTG2的表达直接受miR-25水平的调节。4.食管鳞状细胞癌组织中miR-25呈高表达,BTG2呈低表达。食管鳞状细胞癌组织中miR-25的表达水平与总生存期（OS）和无转移生存率（MFS）呈负相关。食管鳞状细胞癌组织中BTG2的表达水平与总生存期（OS）和无转移生存率（MFS）呈正相关。并发现,miR-25的表达水平与BTG2的表达水平呈负相关。与试验验证miR-25靶向负调控BTG2的表达结果一致。5.miR-25通过靶向负调控BTG2的表达促进食管鳞状细胞癌的进展。miR-25和BTG2可作为预测食管鳞状细胞癌患者预后的生物标志物。