马克斯克鲁维酵母因其广泛的碳源谱及高温下的生长发酵能力受到了越来越多的关注。在马克斯克鲁维酵母进行耐热酶类及生物燃料生产的过程中,葡萄糖抑制效应严重影响了混合碳源的共利用。本文在已有的一株具有多种营养缺陷型筛选标记的马克斯克鲁维酵母Kluyveromyces marxianus YHJ010的基础上,进行基因工程改造,解除了葡萄糖抑制效应,使其能够共利用混合碳源。首先对马克斯克鲁维酵母中存在的可能的葡萄糖抑制效应相关基因,如己糖激酶基因KmHXK(hexokinase)、葡萄糖激酶基因 KmGLK(glucokinase)、KmMIG1(regulatory protein Migl)进行克隆。然后将ScURA3的表达框插入到克隆的基因中间,分别构建了包含三个基因敲除框的敲除质粒。利用同源重组将构建的敲除框整合到马克斯克鲁维酵母基因组对应的基因位置中,敲除基因,构建了三个基因分别敲除的菌株,命名为YLM001(ΔHXK),YLM002(ΔGLK)和 YLM012(ΔMIG1)。对三个敲除菌株在含有2-DG(deoxyglucose)的平板培养基上进行了葡萄糖抑制效应的测试,并在42℃进行混合糖发酵实验,研究这三个基因对解除葡萄糖抑制效应的作用。结果表明HXK的敲除能够解除葡萄糖抑制效应,而GLK和MIG1的敲除对于葡萄糖抑制效应的解除没有明显效果。YLM001葡萄糖抑制效应的解除伴随着葡萄糖代谢速率的明显下降,考虑到GLK的敲除对于葡萄糖抑制效应没有作用,故在敲除HXK的菌株YLM001中过表达GLK以恢复敲除菌株的葡萄糖利用能力。将马克斯克鲁维酵母中的GLK基因克隆置于强启动子PGAPDH的控制下,以营养缺陷型选择标签ScTRP1为选择标记构建基因表达质粒。通过KmGLK表达框的同源重组构建了葡萄糖代谢速度基本恢复的菌株YLM005。经过2-DG平板培养基测试、木糖代谢酶类XR、XDH、XK的酶活测定及转录水平半定量分析,确认过表达一份GLK能够促进酵母利用葡萄糖进行生长,同时并不影响其他碳源的利用。对工程菌株YLM005进行混合糖类发酵研究,证明此菌株能够同时代谢混合碳源。YLM005的成功构建为马克斯克鲁维酵母共利用混合碳源生产耐热酶类及其他产物提供了理论依据。同时在实验室已存在的木糖醇合成菌株YZJ080的基础上敲除HXK基因,用于代谢木糖葡萄糖混合培养基生产木糖醇。改造后的菌株YLM011在79.5g/l木糖和27.2g/l葡萄糖混合培养条件下,以起始OD600=10,在42℃高温发酵可生产67.9g/l的木糖醇,生产速率能够达到1.85g/l/h,木糖醇产率为1.04g/g。YLM011不仅有在高温下共利用葡萄糖木糖生产木糖醇的能力,而且与文献报道的利用酵母生产木糖醇相比,生产速率快,产率高。这为马克思克鲁维酵母利用木糖母液等废料进行工业化木糖醇生产奠定了基础。