尽管医疗水平飞速提高,脓毒症目前仍然缺乏有效的治疗药物,虽然有各种高级生命支持技术,脓毒症的治疗效果并不理想,并且其发生机制也尚未阐明,临床上表现出患病率高、致死率高,治疗费用高的特点,已然成为重要的公共卫生问题。脓毒症是危重症患者发生严重急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)最常见的诱因,并且脓毒症相关的AKI是导致患者死亡的独立危险因素。目前虽然有各种治疗方案对症处理脓毒症相关的AKI,患者死亡率居高不下。然而,我们对于脓毒症AKI的发生发展的病理生理学理论仍然知之甚少。因此阐明脓毒症AKI的发病机制和寻找潜在的治疗药物来降低脓毒症患者的病死率显得极为重要。研究证实保护肾脏功能可降低不同脓毒症模型小鼠的病死率,提示干预肾功能保护这一环节或许能为脓毒症治疗带来新的思路。肾脏是高代谢并富含线粒体的器官,因此肾脏功能的发挥高度依赖于依赖细胞线粒体结构的正常和功能的稳定。当细胞氧化应激失衡,线粒体通透性转变孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)异常开放,大量水和离子进入线粒体基质,引起线粒体肿胀,线粒体外膜破裂,膜电位下降,氧自由基产生增多;大量的活性氧(reactive oxygen species,ROS)损伤线粒体蛋白,膜完整性和DNA受损,膜通透性增加,膜电位下降,线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)拷贝数降低,引起线粒体的功能异常;ATP合成减少,线粒体生物合成降低,能量耗竭;氧自由基和ROS清除障碍,此过程可能导致恶性循环,进一步导致细胞功能障碍,最终导致细胞死亡。近年来有许多临床研究表明,线粒体功能障碍导致细胞能量衰竭与脓毒症患者严重程度和预后明显相关,而改善线粒体的生物发生可能会增加患者的生存率,针对脓毒症时线粒体功能障碍进行干预的研究展现了良好的应用前景。Sirtuin 1(SIRT1)是酵母染色质沉默信息因子调节因子2(silent information regulator 2,Sir2)的同源家族蛋白,广泛表达于几乎所有哺乳动物器官,在衰老、炎症反应、氧化应激、线粒体功能保护、代谢调节和肿瘤形成等方面是一个重要的调节蛋白。SIRT1主要位于细胞核内,通过去乙酰化参与调控细胞代谢、应激反应、衰老和凋亡等过程。有研究表明激活SIRT1可以提高细胞对氧化应激的生存能力,并在神经退行性疾病、糖尿病、心肌损害、肾缺血再灌注等发挥脏器功能保护作用。课题组前期研究表明SIRT1在脓毒症大鼠模型发挥肾脏保护作用,据此我们以人肾小管上皮细胞(human renal tubular epithelial cells,HK-2 cells)构建体外脓毒症肾损伤模型来进一步研究SIRT1在脓毒症肾损伤中的保护作用。过氧化物酶体增殖物激活受体 γ(peroxisome proliferator activated receptorγ,PPAR γ)辅助激活因子-1α(PPARγ coactivator-1α,PGC-1α)是核基因编码的,是氧化代谢和线粒体生物发生的主要调节因子。研究表明SIRT1激活可去乙酰化PGC-1α,提高转录活性;可通过能量限制的方式,减少活性氧等有害物质的产生,减轻对细胞的损伤,可促进细胞ATP的合成,保证细胞能量供应、维持细胞内稳态;可以提高细胞的抗氧化功能,从而延缓细胞衰老,减少细胞凋亡。因此SIRT1可能通过调控PGC-1α在脓毒症肾损伤中发挥保护作用。线粒体转录因子 A(mitochondrial transcription factor A,TFAM)是一种核编码蛋白,在细胞质中合成并导入线粒体,对线粒体起保护作用。TFAM促进mtDNA复制、转录,调控线粒体DNA的拷贝数。TFAM也可非特异性地与线粒体DNA的所有序列结合,保持其结构稳定并形成类核结构。PGC-1α可通过调控核呼吸因子(nuclear respiratory factor,NRF)的活性来促进TFAM的表达。以上研究表明PGC-1α可能通过TFAM在脓毒症中发挥保护作用。基于以上文献回顾及前期研究基础,我们可以提出以下研究假设:SIRT1对LPS引起的肾小管上皮细胞损伤具有保护作用,并且这种保护作用可能依赖于SIRT1的激活。激活SIRT1增强PGC-1α和TFAM的表达,从而发挥细胞功能保护作用。SIRT1/PGC-1 α/TFAM对细胞功能的保护作用是通过保护线粒体功能实现的。目的:课题组前期动物实验已证实激活SIRT1可在脓毒症急性肾损伤中保护肾脏功能,本研究拟在前期研究基础上进行深入的分子机制探讨,因此拟通过构建脓毒症急性肾损伤的细胞模型,综合运用多种分子生物学技术,探讨SIRT1是否通过调控线粒体损伤和PGC-1 a/TFAM通路缓解LPS导致的急性肾损伤。研究结果将为脓毒症的发病机制提供新思路,为脓毒症治疗提供新策略。方法:以HK-2细胞为研究对象,建立LPS刺激的脓毒症细胞模型。运用SIRT1特异性激动剂(SRT1720)和抑制剂(EX527)探讨肾小管上皮细胞和线粒体功能的保护作用是否依赖于SIRT1的激活。进而检测PGC-1a和TFAM的表达来验证SIRT1-PGC-1a-TFAM通路在脓毒症肾小管上皮细胞功能障碍中的保护作用。线粒体功能检测:采用JC-1检测线粒体膜电势;采用TMRM检测线粒体通透性转变孔开放情况;采用 CellTiter-Glo(?)Luminescent Cell Viability Assay 检测细胞ATP水平;采用实时荧光定量PCR检测mtDNA拷贝数。ROS水平检测:采用DCFH-DA探针检测细胞内ROS水平;采用MitoSOXTM Red探针进行线粒体内的超氧化物检测水平。结果:1、SRT1720缓解LPS造成的人肾小管上皮细胞SIRT1活性下降结果显示:LPS刺激使SIRT1活性下降,SRT1720能缓解LPS的抑制作用(P<0.05),恢复SIRT1活性,EX527加重LPS的抑制作用,抑制SIRT1活性(P<0.05)。2、SRT1720缓解LPS造成的肾小管上皮细胞SIRT1蛋白表达下降结果显示:与SIRT1活性变化一致,LPS降低SIRT1的蛋白表达水平,SRT1720可缓解LPS造成的HK-2细胞SIRT1蛋白表达下降,有效抑制LPS的作用(P<0.05),EX527加重LPS的抑制作用(P<0.05)。3、SRT1720激活SIRT1从而影响PGC-1a表达水平结果显示:SRT1720 促进 PGC-1a 表达((P<0.05),EX527 和 EX527+LPS抑制 PGC-1a 表达(P<0.05)。4、SRT1720激活SIRT1从而影响TFAM表达水平结果显示:TFAM蛋白变化与PGC-1a保持一致的。SRT1720促进TFAM表达((P<0.05),EX527 和 EX527+LPS 抑制 TFAM 表达(P<0.05)。5、激活SIRT1缓解LPS导致的HK-2细胞线粒体膜电位下降结果显示:与LPS组相比,经SRT1720处理后,JC-1单体形式数量减少,且JC-1多聚体/单体比例升高(P<0.05)。相比之下,经EX527处理,JC-1单体形式数量增加,且JC-1多聚体/单体比例下降(P<0.05)。6、激活SIRT1抑制LPS导致的HK-2细胞线粒体通透性转变孔的开放结果显示:LPS处理组细胞内红色减弱,SRT1720预处理抑制LPS造成的荧光减弱(P<0.05),EX527引起红色荧光的减弱(P<0.05)。7、激活SIRT1促进LPS导致的HK-2细胞线粒体ATP水平恢复结果显示:LPS组细胞内ATP水平较Control组下降,SRT1720预处理后,与LPS组相比,ATP水平升高(P<0.05)。相比之下,EX527预处理后,与LPS组相比,ATP水平下降(P<0.05)。8、激活SIRT1保护LPS处理的HK-2细胞mtDNA拷贝数结果显示:LPS处理后,ND1的相对表达水平较Control明显下降(P<0.05)。SRT1720预处理激活SIRT1可增加LPS处理细胞中ND1的表达(P<0.05)。相比之下,EX527预处理抑制SIRT1可降低ND1的表达(P<0.05)。9、激活SIRT1抑制LPS导致的HK-2细胞胞质ROS产生在细胞质内ROS水平检测中,结果显示:与Control组相比,LPS组ROS的产生增加(P<0.05),使用SIRT1抑制剂EX527处理后,与LPS组相比,ROS生成增加(P<0.05),而使用SRT1720处理后,与Control组和LPS组相比,ROS水平降低(P<0.05)。10、激活SIRT1抑制LPS导致的HK-2细胞线粒体超氧化物产生在线粒体内超氧化物水平检测中,结果显示:与Control组相比,LPS组诱导超氧化物产生增加(P<0.05)。与LPS组相比,SRT1720明显减弱超氧化物的产生(P<0.05),EX527预处理后超氧化物产生增加(P<0.05)。结论:1.LPS引起肾小管上皮细胞SIRT1活性及蛋白表达下降;2.激活SIRT1可促进PGC-1a和TFAM蛋白表达;3.激活SIRT1可抑制LPS导致的线粒体功能障碍;4.激活SIRT1可抑制LPS肾小管上皮细胞ROS增加;5.SIRT1通过促进PGC-1a和TFAM蛋白表达、减少氧化应激,保护线粒体和细胞功能,从而在保护肾脏功能中发挥作用。