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副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,H.parasuis)是巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)嗜血菌属的革兰氏阴性菌,早期定植在猪的上呼吸道,当宿主遭受环境迫害或免疫力下降时,它会扩散到肺部并导致肺炎,甚至进入血液循环并侵入多个组织,引起全身性格拉瑟氏病(Glsser’s Disease),多为纤维性多发性浆膜炎,关节炎和脑膜炎等症状,疾病的爆发对全球养殖者造成了一定影响。细胞致死膨胀毒素(Cytolethal distending toxin,CDT)是H.parasuis的重要毒力因子,由亚基CdtA、CdtB、CdtC组成。为了解副猪嗜血杆菌细胞致死膨胀毒素(HpCDT)与宿主细胞相互作用机制,本研究以PK-15细胞为模型,应用酵母双杂交的方法筛选宿主细胞相互作用蛋白。(1)构建酵母双杂交cDNA文库:提取PK-15细胞的总RNA,运用SMART技术和LD-PCR合成双链cDNA,再将纯化后的ds cDNA与pGADT7-Rec共转化至Y187酵母感受态细胞,在SD/-Leu营养缺陷培养平板上筛选培养,收集PK-15细胞的酵母cDNA文库。经检测,文库滴度达到了7.5×10~7 CFU/mL,插入的双链cDNA片段范围为300~2000 bp,片段平均大小为500 bp。基本符合构建文库的要求,可用于与HpCDT不同亚基蛋白相互作用的蛋白筛选。(2)构建诱饵质粒:以PCR方法扩增cdtA,cdtB,cdtC基因片段,定向克隆至酵母双杂交诱饵载体pGBKT7,利用PEG/LiAc法将空载体pGBKT7及重组载体转化至Y2H Gold酵母感受态细胞,用筛选培养基检测其毒性和自激活活性。双酶切及测序验证正确,成功构建pGBKT7-CdtA,pGBKT7-CdtB,pGBKT7-CdtC诱饵载体;转化产物涂布于SD/-Trp中,空载体pGBKT7及重组载体上酵母数量,大小无明显差异,证明重组载体对其无毒性;转化产物涂布于SD/-Trp,SD/-Trp/X-α-gal平板上,有菌落生长,涂于SD/-Trp/X-α-gal/AbA,无菌落生长,证明重组载体对酵母菌种无自激活活性。成功构建酵母双杂交载体pGBKT7-cdtA,pGBKT7-cdtB及pGBKT7-cdtC,证明其无毒性和自激活活性,为进一步筛选与PK-15细胞文库相互作用蛋白奠定基础。(3)Mating方法筛库及点对点验证:肾上皮细胞(PK-15)cDNA文库构建好的诱饵载体pGBKT7-cdtA,pGBKT7-cdtB,pGBKT7-cdtC进行酵母双杂交筛选,并将杂交液部分涂布到SD/-Leu、SD/-Trp、SD/-Leu/-Trp营养缺陷型平板上,观察菌落的生长状态;剩余的杂交液全部涂布到SD/-Leu/-Trp/X-α-gal/AbA营养缺陷型平板上,筛选相互作用的阳性菌落,筛选到的阳性菌落克隆到SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal/AbA营养缺陷型平板上进行再筛选,重复在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal/AbA营养缺陷型平板上筛选一次,对筛选到的阳性菌落提取质粒,并进行扩大培养,送测序及BLAST分析,最终初步筛选到5种与CdtA相互作用的蛋白,经过回复性验证,分别为线粒体核糖体蛋白S26(MRPS26)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、DNA甲基化结合蛋白3(MBD3)、屏蔽自整合因子1(BANF1)、核糖体蛋白L32(RPL32)。