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引言
卵巢癌作为世界上最具威胁性的女性恶性肿瘤之一,是导致女性死亡的重要疾病。据美国疾病预防工作组(USPSTF)2019年的统计数据表明,每年仅美国地区就有万人以上的患者死于卵巢癌。目前虽然各种化疗药物,例如铂类、紫杉醇等的应用降低了一部分细胞的过度增殖或者迁移情况,抑制卵巢癌的发生发展,改善患者的预后,但是卵巢癌患者总体的五年生存率通常仅为30%左右。虽然盆腔检查、经阴道超声检查和血清CA125在临床诊断中已广泛应用,但很难在早期发现疾病,降低死亡率,因此亟需寻找一种能够在早期发现并且确诊卵巢癌的方法。尽管以铂类和紫杉醇为基础的化疗,最初的临床反应率通常很高,但随后的复发和使用细胞毒性化疗的重复治疗导致对这些治疗的获得性抵抗。因此,针对卵巢癌的发病机制以及卵巢癌的早期诊断和预防机制是当前有关卵巢癌研究的重要方向。找到卵巢癌细胞中影响细胞特性的基因或者分子,使用特异性的抗体或抑制剂,有可能可以有效遏制肿瘤生长和转移,缓解疾病进展。
黏蛋白(mucin antigen,MUC)家族是一类高度糖基化的蛋白,其中多为跨膜蛋白。黏蛋白主要负责形成粘膜的保护屏障,此外黏蛋白还具有许多更特殊的功能,如调节溶质运输或为共生和致病菌提供附着位点,以及和白细胞靶向作用相关,同时黏蛋白还与细胞再生、分化、整合、信号传递、粘附和凋亡相关。MUC16(mucin antigen sixteen,MUC16)是一种在卵巢癌、子宫内膜癌等多种肿瘤中高表达的跨膜黏蛋白。已有报道显示MUC16作为抗黏附分子可以抑制NK细胞与肿瘤细胞之间形成免疫突触,进而抑制NK细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤。同时,MUC16能够与B细胞以及单核细胞结合而调控其免疫行为。另有研究表明MUC16在卵巢癌中高表达,与卵巢癌的转移和浸润密切相关。
本研究首先从TCGA数据和临床样本中证明了MUC16在卵巢上皮性癌中高表达,且与卵巢癌细胞的增殖有关;随后验证了MUC16对卵巢癌细胞的增殖的促进作用。之后本研究对其机制进行了研究,结果表明MUC16可以促进卵巢癌细胞GLUT1的表达,促进卵巢癌细胞的糖摄取能力,加快糖酵解的进程。最后通过免疫缺陷小鼠荷瘤实验,观察和测量小鼠体重和肿瘤大小的变化差异,验证MUC16对卵巢癌细胞的促增殖作用。本研究首次从糖代谢的角度证明了在卵巢上皮性癌中,MUC16可以通过促进GLUT1的表达来促进肿瘤细胞的糖摄取,从而促进肿瘤细胞的糖代谢,为肿瘤细胞的生长提供更多的能量物质,最终通过促进肿瘤细胞的增殖来促进疾病的进展。证明了MUC16不仅可以作为临床诊断的指标,同时可以作为卵巢癌治疗的靶点,为卵巢癌的靶向治疗提供理论依据。
1TCGA数据及临床标本分析MUC16与卵巢癌相关性
目的
分析MUC16在卵巢癌患者临床标本及TCGA数据库中的表达情况。将MUC16表达与MKI67表达进行相关性分析,探讨MUC16的表达在卵巢上皮性癌发生发展中的作用。
方法
(1)TCGA数据库分析MUC16在卵巢癌组织和正常卵巢组织中的表达差异以及和生存的相关性;
(2)TCGA数据库分析卵巢癌组织中MUC16与MKI67表达的相关性;
(3)利用RT-PCR和免疫组化分别在在基因水平和蛋白水平检测临床样本中MUC16在卵巢上皮性癌组织和正常卵巢组织中的表达差异及与增殖基因MKI67的相关性;
(4)分析MUC16的表达对卵巢上皮性癌患者预后的影响。
结果
(1)TCGA数据库分析显示,MUC16在卵巢癌组织中的表达明显高于正常卵巢组织,MUC16高表达的患者总生存期明显低于MUC16低表达患者。
(2)TCGA数据库分析显示,卵巢癌组织中MUC16的表达与肿瘤细胞增殖基因MKI67的表达明显正相关。
(3)RT-PCR和免疫组化结果表明,在临床样本中,MUC16在卵巢上皮性癌组织中的表达水平明显高于正常卵巢组织。同时MUC16的表达与MKI67的表达明显正相关。
(4)卵巢上皮性癌患者生存分析显示,MUC16高表达的患者总生存期及无瘤生存期明显低于MUC16低表达患者。
小结
MUC16在卵巢上皮性癌中高表达,是一种促癌基因。
MUC16高表达的卵巢上皮性癌患者总生存期和无瘤生存期显著低于MUC16低表达的卵巢上皮性癌患者,MUC16表达与卵巢上皮性癌患者的不良预后相关。
MUC16在卵巢上皮性癌的表达与增殖基因MKI67正相关,MUC16与卵巢癌细胞的增殖相关。
2MUC16在卵巢癌细胞系中的表达情况及对细胞系增殖的影响
目的
检测MUC16在卵巢癌细胞系中的表达情况,构建敲低和过表达MUC16的细胞系,在细胞系水平检测MUC16的表达与卵巢癌细胞增殖的关系。
方法
(1)利用流式细胞术检测MUC16在卵巢癌细胞系OVCAR3、HO8910及SKOV3中的表达情况;
(2)利用RNA干扰技术敲低高表达MUC16细胞系中MUC16的表达;
(3)利用慢病毒技术对低表达MUC16的细胞系进行MUC16过表达;
(4)利用CCK8、平板克隆的方法检测MUC16的表达对卵巢癌细胞增殖的影响,利用流式细胞术检测MUC16的表达对KI67表达的影响。
结果
(1)MUC16在OVCAR3、HO8910两株卵巢癌细胞系中高表达,而在SKOV-3细胞系中低表达。
(2)RNA干扰技术成功构建MUC16敲低表达的OVCAR3、HO8910细胞系,慢病毒技术成功构建MUC16过表达的SKOV-3细胞系。CCK8及平板克隆结果显示高表达MUC16的两株细胞系OVCAR3、HO8910在MUC16敲低后增殖明显降低,而低表达MUC16的细胞系SKOV-3在MUC16表达上调后其增殖能力明显变强。
(3)高表达MUC16的两株细胞系OVCAR3、HO8910在MUC16敲低后KI67的表达明显降低,而低表达MUC16的细胞系SKOV-3在MUC16过表达后KI67的表达明显升高。
小结
MUC16在OVCAR3、HO8910两株卵巢癌细胞系中高表达,而在SKOV-3细胞系中低表达。
MUC16能够促进卵巢癌细胞中KI67的表达,促进卵巢癌细胞的增殖。
3MUC16对卵巢癌细胞增殖影响的机制研究
目的
通过TCGA数据库分析、临床标本检测及卵巢癌细胞系实验,探究MUC16表达对卵巢癌细胞增殖影响的机制,检测MUC16与GLUT1、KI67之间的调控关系。
方法
(1)TCGA数据库分析GLUT1在卵巢癌组织和正常卵巢组织中的表达差异以及GLUT1与MUC16表达的相关性;
(2)利用RT-PCR技术和免疫组化分别在在基因水平和蛋白水平检测临床样本中GLUT1在卵巢上皮性癌组织和正常卵巢组织中的表达差异及与MUC16的相关性;
(3)WesternBlot技术检测MUC16与GLUT1之间的相关性;
(4)小分子抑制剂的方法检测MUC16与GLUT1的调控关系;
(5)2-NBDG摄取实验检测MUC16对卵巢癌细胞糖摄取能力的影响。
结果
(1)TCGA数据库分析显示,GLUT1在卵巢癌组织中的表达明显高于正常卵巢组织,卵巢癌组织中GLUT1的表达与MUC16的表达明显正相关。
(2)RT-PCR和免疫组化结果表明,在临床样本中,GLUT1在卵巢上皮性癌组织中的表达水平明显高于正常卵巢组织。同时GLUT1的表达与MUC16的表达明显正相关。
(3)WesternBlot结果显示MUC16能够调控GLUT1的表达。
(4)小分子抑制剂实验的结果显示MUC16通过调控GLUT1的表达,从而促进卵巢癌细胞的增殖。
(5)当卵巢癌细胞系OVCAR3、HO8910的MUC16表达被敲低后,卵巢癌细胞的糖摄取能力明显减弱,同时当卵巢癌细胞系SKOV-3的MUC16表达被升高后,卵巢癌细胞的糖摄取能力明显增强。
小结
GLUT1在卵巢上皮性癌中高表达,MUC16与GLUT1和MKI67之间有明显的正相关的关系。
MUC16通过调控GLUT1的表达,促进卵巢癌细胞的糖摄取和糖酵解能力,影响卵巢癌细胞的增殖。
4小鼠模型验证MUC16在卵巢癌增殖中的作用
目的
以小鼠荷瘤模型为研究对象,通过检测不同组别荷瘤小鼠的体重、肿瘤体积和重量等差异,以及肿瘤中相关基因的表达情况,探究MUC16表达对卵巢癌细胞增殖及成瘤能力的影响。
方法
(1)以卵巢癌细胞系OVCAR3为研究对象,构建MUC16敲低的OVCAR3细胞系(OVCAR3-MUC16-SH),以及作为对照的MUC16正常表达的细胞系(OVCAR3-MUC16-SH-NC);
(2)通过皮下注射的方法给免疫缺陷小鼠(NOD-SCID)注射卵巢癌细胞系,小鼠荷瘤后分别检测不同组别小鼠体重、肿瘤体积和重量等差异;
(3)处死小鼠后将小鼠肿瘤组织取出,利用RT-PCR技术检测不同组别小鼠肿瘤中MKI67和GLUT1基因水平表达差异;
(4)处死小鼠后将小鼠肿瘤组织取出,利用免疫组化技术检测小鼠肿瘤中KI67蛋白的表达差异。
结果
(1)MUC16敲低的OVCAR3荷瘤小鼠的肿瘤体积和重量明显小于对照组小鼠。
(2)MUC16敲低的OVCAR3荷瘤小鼠的体重明显大于对照组小鼠;说明MUC16的表达对荷瘤小鼠的体重有明显影响。
(3)MUC16敲低的OVCAR3荷瘤小鼠肿瘤MKI67及GLUT1基因表达明显下降。
(4)MUC16敲低的OVCAR3荷瘤小鼠肿瘤KI67蛋白表达明显下降。
小结
MUC16对荷瘤小鼠的肿瘤体积、重量及小鼠体重均有明显影响。MUC16可以促进荷瘤小鼠肿瘤KI67及GLUT1的表达。
MUC16的表达能够促进卵巢癌细胞在小鼠体内的成瘤及增殖能力。结论
MUC16是一种在卵巢上皮性癌中高表达的促癌基因,并且跟肿瘤细胞增殖和卵巢上皮性癌患者的不良预后相关。
MUC16在OVCAR3、HO8910两株卵巢癌细胞系中高表达,而在SKOV-3细胞系中低表达。MUC16能够促进卵巢癌细胞系中KI67的表达,促进卵巢癌细胞的增殖。
在卵巢上皮性癌中MUC16与GLUT1和MKI67之间有明显的正相关的关系。MUC16通过调控GLUT1的表达,促进卵巢癌细胞的糖酵解,从而调控KI67的表达,影响卵巢癌细胞的增殖。
MUC16对荷瘤小鼠的肿瘤体积、重量及小鼠体重均有明显影响。MUC16可以促进荷瘤小鼠肿瘤KI67及GLUT1的表达,促进卵巢癌细胞在小鼠体内的成瘤及增殖能力。
卵巢癌作为世界上最具威胁性的女性恶性肿瘤之一,是导致女性死亡的重要疾病。据美国疾病预防工作组(USPSTF)2019年的统计数据表明,每年仅美国地区就有万人以上的患者死于卵巢癌。目前虽然各种化疗药物,例如铂类、紫杉醇等的应用降低了一部分细胞的过度增殖或者迁移情况,抑制卵巢癌的发生发展,改善患者的预后,但是卵巢癌患者总体的五年生存率通常仅为30%左右。虽然盆腔检查、经阴道超声检查和血清CA125在临床诊断中已广泛应用,但很难在早期发现疾病,降低死亡率,因此亟需寻找一种能够在早期发现并且确诊卵巢癌的方法。尽管以铂类和紫杉醇为基础的化疗,最初的临床反应率通常很高,但随后的复发和使用细胞毒性化疗的重复治疗导致对这些治疗的获得性抵抗。因此,针对卵巢癌的发病机制以及卵巢癌的早期诊断和预防机制是当前有关卵巢癌研究的重要方向。找到卵巢癌细胞中影响细胞特性的基因或者分子,使用特异性的抗体或抑制剂,有可能可以有效遏制肿瘤生长和转移,缓解疾病进展。
黏蛋白(mucin antigen,MUC)家族是一类高度糖基化的蛋白,其中多为跨膜蛋白。黏蛋白主要负责形成粘膜的保护屏障,此外黏蛋白还具有许多更特殊的功能,如调节溶质运输或为共生和致病菌提供附着位点,以及和白细胞靶向作用相关,同时黏蛋白还与细胞再生、分化、整合、信号传递、粘附和凋亡相关。MUC16(mucin antigen sixteen,MUC16)是一种在卵巢癌、子宫内膜癌等多种肿瘤中高表达的跨膜黏蛋白。已有报道显示MUC16作为抗黏附分子可以抑制NK细胞与肿瘤细胞之间形成免疫突触,进而抑制NK细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤。同时,MUC16能够与B细胞以及单核细胞结合而调控其免疫行为。另有研究表明MUC16在卵巢癌中高表达,与卵巢癌的转移和浸润密切相关。
本研究首先从TCGA数据和临床样本中证明了MUC16在卵巢上皮性癌中高表达,且与卵巢癌细胞的增殖有关;随后验证了MUC16对卵巢癌细胞的增殖的促进作用。之后本研究对其机制进行了研究,结果表明MUC16可以促进卵巢癌细胞GLUT1的表达,促进卵巢癌细胞的糖摄取能力,加快糖酵解的进程。最后通过免疫缺陷小鼠荷瘤实验,观察和测量小鼠体重和肿瘤大小的变化差异,验证MUC16对卵巢癌细胞的促增殖作用。本研究首次从糖代谢的角度证明了在卵巢上皮性癌中,MUC16可以通过促进GLUT1的表达来促进肿瘤细胞的糖摄取,从而促进肿瘤细胞的糖代谢,为肿瘤细胞的生长提供更多的能量物质,最终通过促进肿瘤细胞的增殖来促进疾病的进展。证明了MUC16不仅可以作为临床诊断的指标,同时可以作为卵巢癌治疗的靶点,为卵巢癌的靶向治疗提供理论依据。
1TCGA数据及临床标本分析MUC16与卵巢癌相关性
目的
分析MUC16在卵巢癌患者临床标本及TCGA数据库中的表达情况。将MUC16表达与MKI67表达进行相关性分析,探讨MUC16的表达在卵巢上皮性癌发生发展中的作用。
方法
(1)TCGA数据库分析MUC16在卵巢癌组织和正常卵巢组织中的表达差异以及和生存的相关性;
(2)TCGA数据库分析卵巢癌组织中MUC16与MKI67表达的相关性;
(3)利用RT-PCR和免疫组化分别在在基因水平和蛋白水平检测临床样本中MUC16在卵巢上皮性癌组织和正常卵巢组织中的表达差异及与增殖基因MKI67的相关性;
(4)分析MUC16的表达对卵巢上皮性癌患者预后的影响。
结果
(1)TCGA数据库分析显示,MUC16在卵巢癌组织中的表达明显高于正常卵巢组织,MUC16高表达的患者总生存期明显低于MUC16低表达患者。
(2)TCGA数据库分析显示,卵巢癌组织中MUC16的表达与肿瘤细胞增殖基因MKI67的表达明显正相关。
(3)RT-PCR和免疫组化结果表明,在临床样本中,MUC16在卵巢上皮性癌组织中的表达水平明显高于正常卵巢组织。同时MUC16的表达与MKI67的表达明显正相关。
(4)卵巢上皮性癌患者生存分析显示,MUC16高表达的患者总生存期及无瘤生存期明显低于MUC16低表达患者。
小结
MUC16在卵巢上皮性癌中高表达,是一种促癌基因。
MUC16高表达的卵巢上皮性癌患者总生存期和无瘤生存期显著低于MUC16低表达的卵巢上皮性癌患者,MUC16表达与卵巢上皮性癌患者的不良预后相关。
MUC16在卵巢上皮性癌的表达与增殖基因MKI67正相关,MUC16与卵巢癌细胞的增殖相关。
2MUC16在卵巢癌细胞系中的表达情况及对细胞系增殖的影响
目的
检测MUC16在卵巢癌细胞系中的表达情况,构建敲低和过表达MUC16的细胞系,在细胞系水平检测MUC16的表达与卵巢癌细胞增殖的关系。
方法
(1)利用流式细胞术检测MUC16在卵巢癌细胞系OVCAR3、HO8910及SKOV3中的表达情况;
(2)利用RNA干扰技术敲低高表达MUC16细胞系中MUC16的表达;
(3)利用慢病毒技术对低表达MUC16的细胞系进行MUC16过表达;
(4)利用CCK8、平板克隆的方法检测MUC16的表达对卵巢癌细胞增殖的影响,利用流式细胞术检测MUC16的表达对KI67表达的影响。
结果
(1)MUC16在OVCAR3、HO8910两株卵巢癌细胞系中高表达,而在SKOV-3细胞系中低表达。
(2)RNA干扰技术成功构建MUC16敲低表达的OVCAR3、HO8910细胞系,慢病毒技术成功构建MUC16过表达的SKOV-3细胞系。CCK8及平板克隆结果显示高表达MUC16的两株细胞系OVCAR3、HO8910在MUC16敲低后增殖明显降低,而低表达MUC16的细胞系SKOV-3在MUC16表达上调后其增殖能力明显变强。
(3)高表达MUC16的两株细胞系OVCAR3、HO8910在MUC16敲低后KI67的表达明显降低,而低表达MUC16的细胞系SKOV-3在MUC16过表达后KI67的表达明显升高。
小结
MUC16在OVCAR3、HO8910两株卵巢癌细胞系中高表达,而在SKOV-3细胞系中低表达。
MUC16能够促进卵巢癌细胞中KI67的表达,促进卵巢癌细胞的增殖。
3MUC16对卵巢癌细胞增殖影响的机制研究
目的
通过TCGA数据库分析、临床标本检测及卵巢癌细胞系实验,探究MUC16表达对卵巢癌细胞增殖影响的机制,检测MUC16与GLUT1、KI67之间的调控关系。
方法
(1)TCGA数据库分析GLUT1在卵巢癌组织和正常卵巢组织中的表达差异以及GLUT1与MUC16表达的相关性;
(2)利用RT-PCR技术和免疫组化分别在在基因水平和蛋白水平检测临床样本中GLUT1在卵巢上皮性癌组织和正常卵巢组织中的表达差异及与MUC16的相关性;
(3)WesternBlot技术检测MUC16与GLUT1之间的相关性;
(4)小分子抑制剂的方法检测MUC16与GLUT1的调控关系;
(5)2-NBDG摄取实验检测MUC16对卵巢癌细胞糖摄取能力的影响。
结果
(1)TCGA数据库分析显示,GLUT1在卵巢癌组织中的表达明显高于正常卵巢组织,卵巢癌组织中GLUT1的表达与MUC16的表达明显正相关。
(2)RT-PCR和免疫组化结果表明,在临床样本中,GLUT1在卵巢上皮性癌组织中的表达水平明显高于正常卵巢组织。同时GLUT1的表达与MUC16的表达明显正相关。
(3)WesternBlot结果显示MUC16能够调控GLUT1的表达。
(4)小分子抑制剂实验的结果显示MUC16通过调控GLUT1的表达,从而促进卵巢癌细胞的增殖。
(5)当卵巢癌细胞系OVCAR3、HO8910的MUC16表达被敲低后,卵巢癌细胞的糖摄取能力明显减弱,同时当卵巢癌细胞系SKOV-3的MUC16表达被升高后,卵巢癌细胞的糖摄取能力明显增强。
小结
GLUT1在卵巢上皮性癌中高表达,MUC16与GLUT1和MKI67之间有明显的正相关的关系。
MUC16通过调控GLUT1的表达,促进卵巢癌细胞的糖摄取和糖酵解能力,影响卵巢癌细胞的增殖。
4小鼠模型验证MUC16在卵巢癌增殖中的作用
目的
以小鼠荷瘤模型为研究对象,通过检测不同组别荷瘤小鼠的体重、肿瘤体积和重量等差异,以及肿瘤中相关基因的表达情况,探究MUC16表达对卵巢癌细胞增殖及成瘤能力的影响。
方法
(1)以卵巢癌细胞系OVCAR3为研究对象,构建MUC16敲低的OVCAR3细胞系(OVCAR3-MUC16-SH),以及作为对照的MUC16正常表达的细胞系(OVCAR3-MUC16-SH-NC);
(2)通过皮下注射的方法给免疫缺陷小鼠(NOD-SCID)注射卵巢癌细胞系,小鼠荷瘤后分别检测不同组别小鼠体重、肿瘤体积和重量等差异;
(3)处死小鼠后将小鼠肿瘤组织取出,利用RT-PCR技术检测不同组别小鼠肿瘤中MKI67和GLUT1基因水平表达差异;
(4)处死小鼠后将小鼠肿瘤组织取出,利用免疫组化技术检测小鼠肿瘤中KI67蛋白的表达差异。
结果
(1)MUC16敲低的OVCAR3荷瘤小鼠的肿瘤体积和重量明显小于对照组小鼠。
(2)MUC16敲低的OVCAR3荷瘤小鼠的体重明显大于对照组小鼠;说明MUC16的表达对荷瘤小鼠的体重有明显影响。
(3)MUC16敲低的OVCAR3荷瘤小鼠肿瘤MKI67及GLUT1基因表达明显下降。
(4)MUC16敲低的OVCAR3荷瘤小鼠肿瘤KI67蛋白表达明显下降。
小结
MUC16对荷瘤小鼠的肿瘤体积、重量及小鼠体重均有明显影响。MUC16可以促进荷瘤小鼠肿瘤KI67及GLUT1的表达。
MUC16的表达能够促进卵巢癌细胞在小鼠体内的成瘤及增殖能力。结论
MUC16是一种在卵巢上皮性癌中高表达的促癌基因,并且跟肿瘤细胞增殖和卵巢上皮性癌患者的不良预后相关。
MUC16在OVCAR3、HO8910两株卵巢癌细胞系中高表达,而在SKOV-3细胞系中低表达。MUC16能够促进卵巢癌细胞系中KI67的表达,促进卵巢癌细胞的增殖。
在卵巢上皮性癌中MUC16与GLUT1和MKI67之间有明显的正相关的关系。MUC16通过调控GLUT1的表达,促进卵巢癌细胞的糖酵解,从而调控KI67的表达,影响卵巢癌细胞的增殖。
MUC16对荷瘤小鼠的肿瘤体积、重量及小鼠体重均有明显影响。MUC16可以促进荷瘤小鼠肿瘤KI67及GLUT1的表达,促进卵巢癌细胞在小鼠体内的成瘤及增殖能力。