维生素C,又名抗坏血酸（L-ascorbic acid,AsA）,是植物和大多数动物体内合成的一类含量丰富的己糖内酯化合物。植物中AsA的重要性不仅在于它为不能正常合成AsA的少数动物（包括人类）提供丰富的维生素C源,而且近年来的研究发现,AsA对于植物自身的抗氧化、光合保护以及调节生长发育等都具有非常重要的作用。尽管抗坏血酸具有重要的功能,但到目前为止,人们对其生物合成和代谢的认识仍很不完全,其中许多代谢相关的酶编码基因都没有克隆到。RNAi技术作为基因功能研究的一种有效手段得到了广泛的应用。本研究旨在利用RNAi技术初步鉴定抗坏血酸代谢相关基因的功能,评价转基因调控抗坏血酸代谢的效果,并获得具有应用潜力的高含量抗坏血酸的番茄材料。 本研究综合利用分子生物学和生物信息学方法手段,对不同物种的EST数据库（TIGR）进行基因序列比较和分析,初步候选出番茄两个抗坏血酸代谢酶基因,即抗坏血酸过氧化酶（APX,Ascorbate peroxidase）基因与抗坏血酸氧化酶启动子结合蛋白（AOBP,Ascorbate oxidase promoter-binding protein）基因。利用RT-PCR获得这两个基因的部分cDNA片段,并将其构建到植物RNAi研究载体pHGRV中,通过对转基因番茄植株及其后代的生理生化特性的鉴定分析,表明这两个基因在一定程度上调控着番茄抗坏血酸的代谢。获得的主要结果如下: 1.利用生物信息学手段,根据基因表达的时空特性,在TIGR EST数据库中候选出两个编号分别为TC154675、TC155602电子克隆基因,预测TC154675可能是APX基因;而TC155602则可能为AOBP基因。 2.通过RT-PCR获得这两个基因的部分片段,并构建了这两个片段的RNAi植物研究载体;利用农杆菌介导的遗传转化方法将它们成功导入番茄品系A57中。 3.提取部分T₀代转化番茄PCR阳性植株的基因组DNA,经Southern杂交分析,证明载体的TDNA区段已经整合到番茄基因组中。 4.A57中经Southern杂交检测的阳性植株,收获T₁代种子。对T₁世代植株PCR扩增分析鉴定,发现单拷贝和两个拷贝的植株NPTⅡ基因在植株体内遗传符合显性单基因孟德尔遗传规律。 5.测定T₁代植株抗坏血酸含量以及抗坏血酸氧化酶,抗坏血酸过氧化酶的活性,发现T₁代转基因植株抗坏血酸含量部分得到提高,抗坏血酸氧化酶,抗坏血酸过氧化酶的活性部分有所降低,各株系间存在一定差异。