【摘 要】
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目的:通过合成稳定的硫量子点（sulfur quantum dots,PEG-S）,观察其对SD大鼠骨关节炎模型中基质金属蛋白酶3（Matrix metalloprotein 3,MMP3）、白介素-6（Interleukin-6,IL-6）、II型胶原（Collagen 2α1,COL2al）、SRY-盒包含蛋白9基因（sex determining region Y-box 9,Sox9）和基
【基金项目】
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项目名称:基于石墨相氮化碳纳米片的双基因协同输送系统用于小鼠胚胎神经干细胞定向诱导分化及脑内移植治疗帕金森疾病,项目合同编号:81860256,项目来源:国家自然科学基金,项目起止时间:2019.01-2022.1
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目的:通过合成稳定的硫量子点（sulfur quantum dots,PEG-S）,观察其对SD大鼠骨关节炎模型中基质金属蛋白酶3（Matrix metalloprotein 3,MMP3）、白介素-6（Interleukin-6,IL-6）、II型胶原（Collagen 2α1,COL2al）、SRY-盒包含蛋白9基因（sex determining region Y-box 9,Sox9）和基质金属蛋白酶抑制基因（tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1）信使核糖核酸（Messenger Ribonucleic Acid,m RNA）表达的影响。以及PEG-S硫量子点对骨关节炎模型关节软骨病理形态变化,初步探讨硫量子点在防治骨关节炎（Osteoarthritis,OA）方面的疗效与机制。方法:本研究分三部分。第一部分:PEG-S量子点的制备及表征研究。（1）首先是PEG-S量子点的合成。将升华硫与聚乙二醇（Polyethylene glycol,PEG）混合,进行系列化学反应,合成稳定的PEG-S量子点。（2）PEG-S量子点的表征。使用扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscope,SEM）、X射线光电子能谱分析（X-ray photoelectron spectroscopy,XPS）、傅里叶红外光谱（Fourier Transform Infrared,FTIR）、紫外分光光度计验证PEGS的化学成分与结构。（3）PEG-S量子点的生物毒性评价。使用CCK-8检测PEG-S量子点的生物毒性。（4）生物细胞成像。将PEG-S量子点与软骨细胞共培养,通过共聚焦激光扫描显微镜,观察其进入细胞的荧光情况。第二部分:PEG-S量子点体外抗骨关节炎活性研究。（1）选取第3代SD大鼠的软骨细胞,随机分为4组:Control组（软骨细胞）;OA组（软骨细胞+IL-1β）;PEG-S1（软骨细胞+IL-1β+PEG-S）;PEG-S2组（软骨细胞+IL-1β+PEG-S）。（2）将PEG-S与软骨细胞共培养2 h后,加入IL-1β诱导炎症,实验采用CCK-8、Calcein-AM/PI染色PEG-S量子点的生物相容性。（3）使用实时荧光定量多聚核苷酸链式反应（Real-time Quantitative polymerase chain reaction,q RT-PCR）探究PEG-S对软骨细胞炎症相关基因MMP3、IL-6和软骨相关基因COL2a1、Sox9、TIMP-1的表达。（4）使用苏木精—伊红染色法（Hematoxylin-eosin staining,H＆E）染色与番红O染色,观察各组软骨细胞形态及数量变化。第三部分:PEG-S量子点体内抗骨关节炎活性研究。采用SD大鼠进行前十字交叉韧带法构建骨关节炎动物模型,动物实验一共分为4组:Control组;OA组;PEG-S1组;PEG-S2组。骨关节炎造模成功后,关节腔注射PEG-S量子点,42 d后取样观察治疗的结果。样本固定后包埋切片,进行H＆E与番红O-固绿染色并进行组织学评分,验证PEG-S量子点在体内OA治疗情况。结果:成功制备PEG-S量子点,并对材料进行表征,检测PEG-S量子点的生物相容性与炎症治疗效果。本研究中结果显示,XPS的元素分析证明了PEG-S量子点的成功合成,FTIR证明了产物中有PEG稳定剂的存在,透射电镜、SEM观察到硫量子点产物粒径约在1.5-3 nm,分布均匀,且具有清晰的晶格条纹。对于软骨细胞具有良好的生物相容性,在添加IL-1β的干预下,PEG-S量子点细胞毒性低,且能促进软骨细胞增殖和提高细胞的活力。通过CCK-8检测与Calcein-AM/PI染色结果显示,PEGS量子点能促进细胞增殖且具有良好的生物容性。与此同时,PEG-S量子点具有优异的骨关节炎治疗作用,对比OA组,PEG-S量子点明显下调炎症标志性基因MMP3与IL-6,上调软骨标志基因COL2a1,Sox9和TIMP-1。综上所述,PEG-S量子点具有良好的生物学性能,促进软骨细胞的增殖,具有抗炎作用。基于前两部分的研究成果,进一步探究PEG-S量子点体内OA治疗效果。体内实验结果显示PEG-S量子点对骨关节炎具有良好的治疗效果。在对SD大鼠切除前十字交叉韧带进行骨关节炎造模成功后,关节腔内注射PEG-S量子点进行治疗。对各组的关节进行拍照观察、评分、组织学染色和组织学评分,结果均显示PEG-S量子点具有骨关节炎治疗作用。结论:PEG-S量子点可通过下调炎症标志性基因MMP3与IL-6的表达,上调软骨标志基因COL2a1,Sox9和TIMP-1,具有抑制炎症,促进软骨细胞增生及保护软骨细胞的作用。PEG-S量子点可以减轻SD大鼠骨关节炎模型中的炎症反应,有望成为OA治疗的新型抗炎药物。
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