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Ⅵ型分泌系统(TypeⅥsecretionsystem，T6SS)是新近发现的存在于革兰氏阴性菌变形菌门部分致病菌中的一种蛋白质分泌系统，是这类细菌的一种重要毒力因子。T6SS是由15～25个基因编码的蛋白形成的贯穿细菌“内膜-周质空间-外膜”的跨膜复合结构，其形成的管道能直接穿过靶细胞的生物膜发挥生物学效应，作用的靶细胞既可以是原核细胞，也可以是真核细胞。溶血素共调节蛋白(Hemolysin-CoregulatedProtein，Hcp)是形成T6SS分泌装置的通道的结构蛋白，同时也是对靶细胞产生生物学效应的重要的效应蛋白，被认为是T6SS的分子标志(hallmark)。
肠外致病性大肠杆菌（ExtraintestinalpathogenicEscherichiacoli，ExPEC）是一类重要的人畜共患传染病病原，能引起人和动物肠道以外多种组织器官病变。近年来，许多猪场发生脑膜炎、肺炎、关节炎、败血症等疾病的猪只ExPEC的分离率呈上升趋势，这类菌株往往具有较强的耐药性，给养殖场疾病的防控带来很大的困难，同时造成养殖场较大的损失。
本研究在前期对5株猪源ExPEC进行基因组测序及比较基因组研究的基础上，发现ExPEC强致病菌株相比弱致病性菌株，其染色质中有完整的T6SS基因簇，其中PCN033菌株具有3个hcp基因(hcp1-3)。本研究通过基因敲除的方法获得ExPECT6SS缺失突变菌株，将其与亲本菌株比较，研究该系统对猪源吞噬细胞、上皮细胞的作用，以及分泌蛋白的差异。主要研究内容如下:
1.肠外致病性大肠杆菌缺失突变株PCN033△hcp3的构建
参照全基因测序获得的猪源ExPECPCN033基因组结构图设计引物，以该菌基因组为模板分别扩增hcp3基因上下游片段，串联并构建重组自杀性质粒pRE△hcp3，通过结合转移将重组质粒导入野生菌株PCN033，利用Cm抗性和蔗糖敏感性筛选接合子。将PCR鉴定正确的接合子在不含NaCl的LB培养基中传代培养，促使第二次同源重组发生，再筛选出Cm敏感、蔗糖抗性的克隆，PCR鉴定以确定发生了第二次交换，得到hcp3基因缺失突变株PCN033△hcp3。
2.肠外致病性大肠杆菌Hcp1多克隆抗体的制备及鉴定
参照基因序列设计引物，以该菌基因组为模板扩增hcp1基因，构建原核表达质粒pET30a-hcp1，转化入宿主菌大肠杆菌BL21，通过IPTG诱导获得融合表达蛋白Hcp-His，利用镍离子亲和层析柱纯化蛋白作为免疫原蛋白，免疫2月龄的大耳白兔，14d后第二次免疫，一周后采集少量血清，经westernblot鉴定其具有反应性与特异性，再收集血清获得Hcp1多克隆抗体。
3.肠外致病性大肠杆菌分泌蛋白的提取及Hcp1蛋白的鉴定
将活化的ExPEC亲本株PCN033和T6SS缺失突变株PCN033△hcp3的菌液转接到M9培养基，于37℃振荡培养24h，获得的菌液去除菌体沉淀，利用三氯乙酸沉淀法提取这两株菌菌液上清中的分泌蛋白。以制备的Hcp1多克隆抗体为一抗，通过Westernblot检测分泌蛋白中存在Hcp蛋白，证明ExPEC亲本菌株PCN033的T6SS具有活性，同时通过比较亲本株和缺失突变株Hcp蛋白分泌量的差异，发现hcp3基因的缺失减弱了该菌株Hcp蛋白的分泌。
4.肠外致病性大肠杆菌缺失突变株致病力的研究
将缺失突变株PCN033△hcp3及其亲本株PCN033以106、107、108三个梯度的菌量，通过腹腔注射途径感染BalB/C小鼠，结果表明，这两株菌对小鼠的致死率几乎没有差异;按菌落形成单位与细胞数10∶1的比值，分别将PCN033△hcp3和PCN033与小鼠单核巨噬细胞(RAW)在37℃CO2培养箱共孵育，分别在第1h，2h和3h进行细胞内存活菌量的平板计数，结果显示两株菌在RAW内的存活菌量的比较在3个时间点都没有差异;而同样的方法在猪肺泡巨噬细胞（PAM）中，PCN033和PCN033△hcp3存活菌量存在着较显著的差异，尤其第3h差异最显著，分别是3560cfu/mL，833cfu/mL，比值为4.27;同样将PCN033和PCN033△hcp3与猪肾上皮细胞(PK-15)在37℃CO2培养箱共孵育3h，菌株入侵到细胞内的平均菌量分别为1427cfu/mL，1317cfu/mL，而粘附于细胞表面的平均菌量分别为5840cfu/mL，1256cfu/mL，表明hcp3基因的缺失减弱了菌株对细胞侵袭的能力，体现为粘附能力的下降。