论文部分内容阅读
中红侧沟茧蜂Microplitis mediator是棉铃虫Helicoverpa armigera等鳞翅目害虫的重要寄生性天敌昆虫,利用中红侧沟茧蜂进行生物防治既能有效控制害虫,又符合有害生物绿色防控的宗旨。在田间,中红侧沟茧蜂主要通过敏锐的嗅觉系统来识别外界的信息化学物并定位寄主,而嗅觉系统中的气味运载蛋白参与了初级阶段的气味识别,因此气味运载蛋白在昆虫嗅觉识别行为中扮演着重要角色。Niemann–Pick type C2(NPC2)蛋白是一种小分子可溶性蛋白,在脊椎动物中主要参与脂质代谢。最近有研究表明,NPC2蛋白也参与节肢动物的化学通讯,具有与气味结合蛋白相似的功能。本文以中红侧沟茧蜂NPC2蛋白为研究对象,从RNA水平、蛋白水平和电生理水平系统解析了中红侧沟茧蜂NPC2蛋白的潜在功能。本试验主要研究结果如下:1.基于前期中红侧沟茧蜂转录组测序结果,利用cDNA末端快速扩增技术技术获得了两个NPC2基因序列全长,分别命名为MmedNPC2a和MmedNPC2b,其编码的氨基酸个数分别为148和158,两者氨基酸序列一致性为26.09%。系统发育分析表明,MmedNPC2a和MmedNPC2b均属于NPC2基因家族,分属于不同的进化枝,其中MmedNPC2a与参与嗅觉通讯的日本弓背蚁CjapNPC2属同一进化枝。荧光定量PCR对MmedNPC2a与Mmed NPC2b在中红侧沟茧蜂不同组织中的表达谱的研究结果表明,MmedNPC2a在触角的表达量显著高于头、胸、腹、足和翅,且明显高于MmedNPC2b。因此,推测MmedNPC2a可能参与中红侧沟茧蜂的嗅觉通讯功能。2.对MmedNPC2a和MmedNPC2b进行了基因克隆、蛋白重组表达和纯化,并合成了特异性多克隆抗体。胶体金免疫定位结果显示,MmedNPC2a位于中红侧沟茧蜂嗅觉感器——板形感器的淋巴液中,MmedNPC2b则存在于触角中心淋巴液,在嗅觉感器中没有发现其分布。两种蛋白不同的分布部位表明他们可能行使不同功能,据此推测MmedNPC2a可能主要参与嗅觉识别过程。3.荧光竞争结合试验结果表明,在测定的54种气味挥发物中,MmedNPC2a能够特异结合4-乙基苯甲醛、3,4-二甲基苯甲醛、β-紫罗兰酮、芳樟醇、间二甲苯、苯甲醛及反-2-己烯醛。初步表明Mmed NPC2a参与中红侧沟茧蜂定位寄主植物的化学感受过程。利用SWISS-MODEL构建了MmedNPC2a三维模型,通过Swiss-PdbViewer与CjapNPC2进行了结构对比分析。结果表明,MmedNPC2a具有7个β折叠和3个二硫键,CjapNPC2结合油酸的关键位点Lue68、Lys69、Lys70、Phe97、Thr103和Phe127位点在MmedNPC2a中依次被Phe85、Ser86、His87、Leu113、Tyr119和Ile143取代,这可能是MmedNPC2a与CjapNPC2配体结合谱不一致的原因。4.采用触角电位(electroantennogram,EAG)试验测定了中红侧沟茧蜂触角与7种挥发物的电生理反应。结果显示,中红侧沟茧蜂触角对芳樟醇、4-乙基苯甲醛、反-2-己烯醛具有强烈的电生理反应,进一步证实MmedNPC2a可能参与中红侧沟茧蜂嗅觉识别过程。上述结果为中红侧沟茧蜂嗅觉感受系统的深入研究提供了理论依据,对设计中红侧沟茧蜂嗅觉行为调控剂及“控害保益”策略具有重要指导意义。