论文部分内容阅读
目的:小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)治疗肿瘤具有明显的疗效,大大改善了患者的存活率。这些激酶抑制剂的靶点是酪氨酸激酶的ATP绑定口袋(ATP binding pockets),通过阻碍ATP和激酶的结合,从而抑制激酶下激活。然而部分TKIs具有显著的心脏毒性,主要表现为左室收缩功能障碍,严重者可引发心衰。目前为止,在临床应用的30个TKIs中,有多个在说明书中标有心脏毒性黑框警告。由于TKIs引发心脏收缩功能障碍确切的分子机制了解有限,目前尚无特异防治策略。心肌细胞内的酪氨酸激酶具有重要生理作用,TKIs可能抑制心脏和肿瘤共有的激酶产生靶向(on-target)作用,同时也可能抑制或影响了抗肿瘤靶点以外的激酶而产生脱靶(off-target)效应。已知心肌细胞正常收缩取决于ATP能量供给和兴奋-收缩耦联(ECC)过程,有众多激酶参与调控,其中磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)对维持心肌细胞内Ca2+循环及收缩至关重要。本课题组前期研究结果发现,上调PI3K会显著保护苏尼替尼导致的心脏收缩功能障碍。已知苏尼替尼是主要抑制受体酪酸激酶的多靶点药物,上调PI3K是否会保护其它TKIs引发的心肌收缩障碍吗?为回答此问题,本课题在人诱导干细胞分化的心肌细胞(hi PSC-CMs)上进一步平行观察了上调PI3K对苏尼替尼和另外三个不同激酶作用靶点的伊马替尼、曲美替尼、索拉非尼等临床报道有心脏毒性的TKIs的保护作用,预期为临床防治TKIs造成的心室收缩障碍提供新思路。方法:1、全自动心肌细胞多功能检测平台(Cardio Excyte 96心肌细胞实时监测系统)检测:复苏hi PSC-CMs(北京赛贝公司),以台盼蓝染色计数,按3.0万/孔的细胞密度接种于NSP-96电极板内,以单层细胞阻抗值(AMP)代表细胞收缩幅度,实时动态监测hi PSC-CMs收缩。平行观察苏尼替尼、伊马替尼、曲美替尼、索拉非尼四种TKIs对hi PSC-CMs细胞收缩的影响,然后观察提高PI3K活性对上述药物抑制收缩的影响。实验中采用了两种方法增加PI3K活性,一是提前孵育PI3K上游底物PIP3,另一种通过腺病毒中介过表达PI3K(p110α)。2、q RT-PCR技术检测心房利尿钠肽(ANP)、脑利尿钠肽(BNP)、β-肌球蛋白重链(β-MHC)等细胞损伤biomarker m RNA表达:使用微量样品总RNA提取试剂盒,提取hi PSC-CMs细胞的RNA,逆转录为c DNA后,经q RT-PCR检测ANP、BNP、β-MHC的m RNA表达情况。3、其它细胞毒性指标:活性氧(ROS)水平采用Reactive Oxygen Species Assay Kit ROS检测试剂盒做荧光标记染色后,用共聚焦显微镜检测荧光信号。结果:1、心肌细胞收缩实时监测发现,四种TKIs可显著抑制细胞收缩;预先孵育PIP3可以显著预防苏尼替尼、伊马替尼、曲美替尼导致hi PSC-CMs收缩抑制,但对索拉非尼导致收缩抑制没有预防作用。2、四种TKIs均可显著提高心肌毒性标志物ANP、BNP、β-MHC的表达,事先孵育PIP3对苏尼替尼、伊马替尼、曲美替尼引发的上述标志物升高有显著预防作用,但对索拉非尼引发的标志物升高无明显影响。与Cardio Excyte 96监测结果一致。测定细胞内ROS水平发现,四种TKIs类药物均显著升高ROS的释放。3、TKIs孵育前48小时以腺病毒转染细胞,结果发现过表达p110α能够显著保护苏尼替尼、伊马替尼、曲美替尼导致hi PSC-CMs收缩抑制,而对索拉非尼导致收缩抑制没有预防作用。结论:本研究在细胞水平表明激活PI3K可以显著保护苏尼替尼、伊马替尼、曲美替尼导致心肌细胞收缩减弱,提示上调PI3K激酶通路可能对多数TKIs具有保护作用,但对索拉非尼导致的细胞收缩抑制无预防作用,提示保护作用可能具有靶点作用的选择性,具体机制需要进一步研究。实验结果将为TKIs类药物研发及临床防治该类药物心脏毒性提供参考。