论文部分内容阅读
阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease,AD）是以痴呆以及进行性认知功能障碍为主要临床表现的神经系统退行性疾病。细胞外不溶性Aβ沉积形成的老年斑（senile plaques,SPs）以及过度磷酸化tau蛋白形成的神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles,NFTs）等为AD的主要病理标志。随着老年化人口数量的不断增长,痴呆症的患病人数逐年增加,但是临床上仍无有效的治疗途径。长久以来,“Aβ蛋白级联假说”为AD发生与发展提供了主要的依据:不溶性Aβ蛋白在脑中沉积,并逐渐引发突触功能障碍、炎症、神经元丢失,最终导致痴呆。D-丝氨酸（D-serine）是一种广泛存在于哺乳动物脑内的星形胶质细胞递质,并且通过作用于NMDAR的甘氨酸（Gly）位点,或者通过参与长时程增强发挥其对应的作用。D-serine对于改善大鼠的认知功能及其他神经系统疾病具有显著疗效,但其疗效的具体作用机制仍不明确。D-氨基酸氧化酶（D-amino acid oxidase,DAAO）是D-serine的氧化酶,在体内能够起到代谢D-serine的作用;苯甲酸钠（Sodium benzoate,BE）是DAAO的竞争性抑制剂,通过与其活性中心相结合起到抑制DAAO的作用。本实验通过DAAO与BE对D-serine的作用,从两个方面探讨D-serine对Aβ1-42诱导的AD模型小鼠学习,记忆及认知功能的改变情况与其可能的作用机制,为D-serine改善AD提供理论依据。研究目的:本实验检测D-serine对由β淀粉样蛋白诱导的AD模型小鼠认知障碍的改变情况,探讨D-serine对于AD的改善作用与其作用机制,旨在为临床上AD的预防及改善提供一定的理论依据。研究方法:1、42只SPF级昆明小鼠随机分为6组,包括对照组（Control）,假手术组（Sham）,Aβ组（Aβ）,Aβ+D-serine组（Aβ+D-serine）,Aβ+DAAO组（Aβ+DAAO）,Aβ+BE组（Aβ+BE）,每组7只。之后,模型组小鼠使用脑立体定位仪于双侧海马CA1区微量注射Aβ1-42（2μl,2.0μg/μl）。假手术组小鼠海马相同位置注射等量生理盐水。造模后两天,模型组小鼠分别腹腔注射10天生理盐水、D-serine（30 mg/kg）、DAAO（30 mg/kg）、BE（30 mg/kg）,正常组不做任何处理。2、小鼠腹腔注射给药后进行行为学试验（新物体识别试验和旷场试验）用以分析给药D-serine对各组小鼠的学习记忆以及认知功能的影响。3、使用银染法检测各组小鼠海马区外源性Aβ沉积的分布以及表达变化情况。4、使用免疫组织化学法检测各组小鼠海马区Aβ,GFAP,TNF-α,NMDAR1,p-JNK,p-c-Jun,ATF2以及IL-1β,p-MAPT（S404）,p-GSK3β阳性表达情况。5、Western blot方法检测海马区GFAP,TNF-α,NMDAR1,p-JNK,JNK,p-c-Jun,c-Jun,ATF2以及IL-1β,p-MAPT（S404）,p-GSK3β蛋白表达的具体变化。研究结果:1、行为学试验结果显示:（a）新物体识别试验:对照组与假手术组小鼠认知指数无显著性差异（P>0.05）,而Aβ组小鼠认知指数显著降低（P<0.01）;与Aβ组相比,Aβ+D-serine组小鼠认知指数明显升高（P<0.01）;（b）旷场试验:与对照组相比,Aβ组小鼠运动总路程以及运动平均速度明显降低,站立次数明显减少（P<0.01）;当给药D-serine后,Aβ+D-serine组小鼠运动总路程和运动平均速度明显升高,站立次数明显增多（P<0.01）。2、银染法实验结果显示:对照组与假手术组小鼠海马区染色均一,神经原纤维排列整齐,密集,未见Aβ沉积形成的黑色斑块;Aβ组神经原纤维缠绕明显,可见大量Aβ斑块,分布密集;Aβ+D-serine组可见少量Aβ斑块,分布稀疏。3、免疫组织化学法结果显示:与对照组相比,Aβ组GFAP,TNF-α,p-JNK,p-c-Jun,ATF2,NMDAR1以及IL-1β,p-MAPT（S404）阳性细胞表达明显增多（P<0.01）,而p-GSK3β阳性细胞表达明显减少（P<0.01）;而与Aβ组相比,Aβ+D-serine组GFAP,TNF-α,p-JNK,p-c-Jun,ATF2,NMDAR1以及IL-1β,p-MAPT（S404）阳性细胞表达明显减少（P<0.01）,p-GSK3β阳性细胞表达明显增多（P<0.01）。4、Western blot实验结果与免疫组化实验结果相一致。研究结论:1、小鼠海马CA1区微量注射Aβ1-42可产生AD样病理改变以及使小鼠学习记忆、认知功能障碍。2、D-serine能够改善Aβ诱导的小鼠记忆以及认知功能障碍。3、D-serine处理后可能通过（a）:作用于NMDAR的Gly位点抑制JNK信号通路从而改善AD模型小鼠认知障碍;（b）:作用于GSK3β信号通路抑制tau蛋白的过度磷酸化。