基于纳米材料的电化学发光免疫分析新方法研究

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本论文对电化学发光(ECL)、电化学发光免疫分析(ECLIA)及其应用进行了较为系统的综述。量子点因其良好的生物相容性和独特的发光特性而被广泛应用于ECL免疫传感器构建中;石墨烯及其纳米复合物具有优异的光学、电学性质,已成为高效分析检测领域的研究热点。本研究将生物技术、纳米技术和ECL技术有机结合起来,开发了一系列ECL免疫传感器,达到了高灵敏度检测肿瘤标志物的目的。具体包括如下内容:1、基于石墨烯-CdS量子点-琼脂糖复合材料的超高灵敏度检测甲胎蛋白的电化学发光免疫传感器通过CdS量子点(QDs)、石墨烯(G)、琼脂糖复合,成功制备了一种可增强电化学发光的G-CdS-agarose复合材料。利用该材料构建的免标记电化学发光(ECL)免疫传感器可超高灵敏检测甲胎蛋白(AFP)。首先,滴涂于玻碳电极表面的G-CdS-agarose复合材料可形成均匀的膜,并具有强的ECL、好的生物相容性及高的稳定性。然后,将交联剂3-氨丙基三乙氧基硅烷(APS)滴涂于复合材料膜表面,ECL信号明显增强。最后通过戊二醛(GLD)将AFP抗体(Ab)组装,成功构建ECL免疫传感器。由于AFP抗原与抗体之间特异性的反应,导致体系ECL强度降低,降低值与AFP浓度对数之间呈现良好线性关系,线性范围为0.000550pg/mL,检测限为0.2fg/mL。该免疫传感器具有灵敏度高、选择性好、特异性强等特点,具备临床应用的潜力。此外,G-CdS-agarose复合材料具有很强的ECL信号,为石墨烯及量子点在免疫分析方面的应用开辟了一种新途径。2、基于量子点猝灭Ru(bpy)32+的电化学发光共振能量转移超高灵敏度检测癌胚抗原的免疫传感器开发了一种超高灵敏度检测人体血清和唾液样品中癌胚抗原(CEA)的电化学发光免疫传感器。Ru(bpy)32+-graphene-Nafion复合物首次被修饰到玻碳电极表面,用于此ECL免疫传感器的构建。第一抗体与第二抗体通过夹心型免疫反应桥连了供体Ru(bpy)32+与受体量子点,量子点可以有效地猝灭供体Ru(bpy)32+的ECL信号。在最优的实验条件下,体系的ECL信号猝灭值与CEA浓度对数之间呈良好线性关系,线性范围为0.0050.5pg/mL,检测限为0.002pg/mL。此外,该传感器具有良好的稳定性、特异性,可对较低水平的CEA进行高灵敏检测。3、基于量子点电化学发光共振能量转移检测ag级甲胎蛋白的免疫传感器本研究成功构建了一种超高灵敏检测甲胎蛋白(AFP)的电化学发光(ECL)免疫传感器。利用石墨烯、CdS量子点与海藻酸钠之间的静电作用,制备了石墨烯-CdS量子点-海藻酸钠复合材料(G-CdS QDs-AL)。将G-CdS QDs-AL复合材料作为供体光源,CdSe/ZnS QDs作为受体光源标记物,基于能量转移机理,层层组装构建了ECL免疫传感器。CdSe/ZnS QDs可以有效猝灭供体光源G-CdSQDs-AL复合材料的ECL,体系的ECL猝灭值与AFP浓度对数呈良好线性关系,线性范围为0.05500fg/mL,检测限为20ag/mL。该方法稳定性好、特异性强、灵敏度高。4、基于多色量子点标记抗体及石墨烯作为导电桥超高灵敏度同时检测两种肿瘤标志物的多通道电化学发光免疫分析本研究利用多色量子点作为标记物、石墨烯作为导电桥,开发了同时检测甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)的多通道电化学发光(ECL)免疫分析方法。利用层层组装方法分别将QDs525标记的AFP第二抗体和QDs625标记的CEA第二抗体同时结合到玻碳电极表面,结合带通滤光片的分光作用,分别获得两者的ECL信号。由于石墨烯具有良好的导电性,以之为导电桥,可将超出电极反应区域的部分标记在第二抗体的量子点与电极连通,有效促进量子点与电极之间的电子转移速率,增强电化学发光强度约30倍。实验结果表明:该多通道ECL免疫分析方法可同时检测AFP和CEA,检测的线性范围为0.0010.1pg/mL,检测限低至0.4fg/mL。该免疫分析方法的精密度、回收率和稳定性良好,实验过程中无交叉反应。该新型多通道ECL免疫分析方法简单、灵敏,具有良好的特异性和稳定性,在肿瘤标志物的临床分析中具有潜在的应用价值。
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