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牛传染性鼻气管炎(Infectious Bovine Rhinotracheitis,IBR)又称"坏死性鼻炎"、"红鼻病"等,是I型牛疱疹病毒(BoHV-1)引起的一种牛呼吸道接触性传染病,是引起牛呼吸道疾病的一个重要的致病原。常呈现脑炎、结膜炎、呼吸道感染、产奶下降以及牛致病性细菌性肺炎等临床症状,BoHV-1受环境等因素影响感染率较高,犊牛较成年牛病死率较高。随着集约化养殖,从而使得该病迅速传播。由于该病在我国大部分地区流行传播,为我国二类动物疫病,也是进出口必检动物疫病。因此,积极开展BoHV-1的研究对于防控该病有重要意义。为适应我国诊断BoHV-1的需要,本研究克隆了gL、gG两个基因,并分别构建了gL、gG原核表达载体,获得了gL、gG的原核高效表达,建立了间接ELISA方法。本研究分为以下三个部分:1.BoHV-1 gL、gG基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达利用牛传染性鼻气管炎病毒(BoHV-1)接种牛肾细胞(MDBK),提取病毒DNA为模板。根据其免疫原性和载体的要求设计对应引物,通过PCR方法扩增BoHV-1的gL、gG基因,PCR产物纯化后经Bam HⅠ和Eco RⅠ双酶切后,克隆到原核表达载体pET-32a,获得重组表达质粒pET32a-gL、pET32a-gG。经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转化表达菌BL21(DE3),并构建了以BL21(DE3)为宿主菌株的原核表达系统,经大量摇菌培养和IPTG诱导以及SDS-PAGE确定DNA序列gL、gG能在pET-32a/BL21(DE3)中表达,成功表达出了gL、gG蛋白,其分子量约分别为37kD、67kD,与预期结果相符,表达的重组蛋白分别为包涵体及上清表达,采用Ni-Agarose Resin方法纯化融合重组蛋白,取得较好的效果。Western blot分析,纯化的pET-gL、pET-gG重组融合蛋白与BoHV-1标准阳性血清呈现良好的反应性。2.gL-iELISA方法的建立以纯化后的pET-32a-gL为诊断抗原包被聚苯乙烯微量反应板,初步建立了检测BoHV-1抗体的间接ELISA方法,优化反应各个条件为:抗原的最佳包被浓度为0.773 ug/mL,血清稀释度为1:20,4℃包被过夜,3%BSA封闭液封闭1h,血清室温孵育半小时,HRP标记兔抗牛IgG稀释度为1:3000,37℃孵育半小时,最佳底物反应条件为37℃5min,建立牛传染性鼻气管炎间接ELISA检测方法,并确定阴阳性临界值。应用建立的gL-iELISA方法检测牛传染性鼻气管炎阳性血清、牛口蹄疫O型阳性血清及牛布鲁氏菌阳性血清,特异性良好;IBRV阳性血清按1:640稀释检测结果仍为阳性。检测171份临床血清,结果显示,67份为阳性,阳性率达39%。3.gG-iELISA方法的建立以纯化后的pET-32a-gG为诊断抗原包被聚苯乙烯微量反应板,初步建立了检测BoHV-1抗体的间接ELISA方法,优化反应各个条件为:抗原的最佳包被浓度为0.1563 ug/mL,条件为室温1h+4℃过夜,1%BSA封闭1h,血清1:20稀释,37℃孵育30min,HRP标记兔抗牛IgG稀释度为1:15000,37℃孵育30min,最佳底物显色条件为37℃5min,建立牛传染性鼻气管炎间接ELISA检测方法,并确定阴阳性临界值为。应用建立的gG-iELISA方法检测牛传染性鼻气管炎阳性血清、牛口蹄疫O型阳性血清及牛布鲁氏菌阳性血清,特异性良好;IBRV阳性血清按1:640稀释检测结果仍为阳性。检测171份临床血清,结果显示,69份为阳性,阳性率达40.35%。此研究可以用于BoHV-1感染的诊断和疫苗免疫后的抗体监测,为重组抗原ELISA试剂盒奠定了基础。