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类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种复杂的全身性自身免疫病,其发病机制尚不完全清楚。虽然研究者们对RA进行了多年的研究,但是目前仍没有发现能够持续缓解或有效治疗RA的药物。RA的主要临床表现为手、指等关节滑膜炎症,其中成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocyte,FLS）异常增生在RA的发病机制中发挥重要作用。芳香烃受体（aryl hydrocarbon receptor,Ahr）作为一种由配体激活的核转录因子,在许多细胞、组织中被发现,被认为是调节免疫反应的关键因素。目前,Ahr激动介导的免疫调节机制在多种自身免疫病中报道,如自身免疫性关节炎、实验性自身免疫性脑脊髓炎和实验性结肠炎等。研究表明,RA患者滑膜组织和关节滑液中Ahr的表达显著升高,提示Ahr的过度激活可能导致FLS的异常增殖,进而导致RA的恶变和骨质破坏。在动物模型实验中,检测出CIA小鼠腹股沟淋巴结和FLS细胞中Ahr的表达较高,Ahr-/-CIA小鼠的关节滑膜的损伤程度较CIA小鼠显著降低。进一步研究发现,特异性敲除小鼠T细胞中的Ahr导致Th17减少,CIA关节炎症明显减轻。研究报道,当RA患者的FLS细胞系和RA滑膜细胞受到Ahr配体刺激时,会上调促炎性细胞因子如IL-1β、IL-6的分泌水平,提示Ahr参与滑膜细胞功能的调控,Ahr信号通路的过度激活在RA发展中发挥重要作用。芍药苷-6-氧-苯磺酸酯（the novel compound paeoniflorin-6′-O-benzene sulfonate,code:CP-25）,作为我所自主研发的一种新型化合物,是一种基于芍药苷（paeoniflorin,Pae）结构修饰的新型活性单体。课题组前期研究发现CP-25可以通过调控G蛋白偶联受体激酶2（G protein-coupled receptorkinases,GRK2）抑制FLS功能、恢复免疫细胞亚群的比例等,显著抑制佐剂性关节炎（adjuvant arthritis,AA）大鼠的全身和局部关节滑膜炎性反应,具有较好的治疗作用。所以本课题以FLS为研究对象,通过在体内建立AA大鼠模型,同时给予CP-25治疗,体内实验研究CP-25影响Ahr表达的作用。体外运用MH7A细胞株,在Ahr内源性配体Kyn的刺激下,研究Ahr激活后对MH7A功能的影响以及CP-25对Ahr表达的调控以及Ahr和GRK2相互作用的影响及部分机制。目的:1. 明确CP-25通过调控Ahr的表达发挥治疗自身免疫性关节炎的作用。2.阐明CP-25抑制滑膜细胞Ahr的表达以及调控Ahr和和GRK2相互作用,是其发挥治疗作用的机制之一。方法:1. Wistar大鼠建立AA模型,成模后随机分为模型组、CP-25组（50mg/kg/day）、Paroxetine组（15mg/kg/day）、CP-25（50mg/kg/day）和Paroxetine（15mg/kg/day）联合给药组,同时设一个正常对照组。根据大鼠的体重计算每只老鼠每日所需剂量,每天通过灌胃给药一次,给药时间为16天。正常组和AA组给予生理盐水进行平行对照。2. 每3天进行一次体重、关节炎指数、足爪肿胀数、全身评分以及足爪肿胀容积的测量和评估记录;计算胸腺和脾脏指数;CCK-8检测大鼠胸腺T细胞和脾脏B细胞的增殖能力;脾脏及关节组织用HE染色,观察病理变化并评分;采用ELISA法检测各组大鼠血清中IL-1β的表达情况。3.分离和培养正常组、AA组及各给药组大鼠的FLS细胞,采用Western blot法和激光共聚焦法检测Ahr的表达变化;采用CCK-8法检测各组FLS的增殖能力;采用ELISA法检测各组FLS培养上清中IL-1β的表达情况。4.体外实验:通过Western blot、激光共聚焦法、CCK-8法和Transwell plate法检测CP-25对Kyn刺激的MH7A细胞中Ahr表达和功能的影响;采用CCK-8法和Transwell plate法检测干扰Ahr后的MH7A细胞增殖和迁移能力的影响;采用免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）和激光共聚焦法检测GRK2和Ahr的相互作用;Q-PCR检测CP-25对Kyn刺激下的MH7A细胞中CYP1A1表达的影响。结果:1.CP-25体内给药对AA大鼠整体指标、病理学表现及炎性因子的影响CP-25明显减轻AA大鼠的关节炎指数、足爪肿胀数和足爪肿胀度,CP-25+Paroxetine联合用药的效果比单独用药更明显;CP-25显著改善AA大鼠膝关节和脾脏组织的病理学变化;ELISA结果显示,炎性状态下,血清和滑膜细胞培养上清中IL-1β的表达明显升高,CP-25和帕罗西汀可以下调IL-1β的水平,CP-25+Paroxetine联合用药组的效果较各单独用药无显著统计学差异。2. CP-25体内给药对AA大鼠关节滑膜组织中Ahr表达及免疫细胞功能的影响免疫组化结果显示,AA大鼠关节滑膜中Ahr的表达相比于正常组明显升高,提示Ahr参与关节滑膜的病理改变,CP-25可以下调Ahr的表达;CCK-8结果显示,CP-25明显降低胸腺T细胞和脾脏B细胞的增殖反应。3. CP-25体内给药对AA大鼠滑膜细胞Ahr表达和增殖的影响Western blot法和激光共聚焦法均显示,和正常组相比,AA大鼠FLS中Ahr总表达及核表达明显升高,提示炎性环境下Ahr表达增加且有明显的核内转移,CP-25可以下调Ahr的表达;CCK-8结果显示,CP-25给药后能明显抑制FLS的增殖。4. CP-25体外给药对Kyn刺激后的MH7A细胞Ahr表达及功能的影响与对照组相比,Kyn（200μM）处理48h后明显促进MH7A细胞的增殖和迁移,体外给予CP-25处理后对MH7A细胞的增殖和迁移均有抑制作用。Western blot法和激光共聚焦法均显示,Kyn（200μM）可以明显增加MH7A细胞Ahr的表达,CP-25(10-5mol/L)处理48h后可以显著下调Ahr的表达。Q-PCR结果显示,Kyn（200μM）促进MH7A细胞CYP1A1的表达,CP-25(10-5mol/L)可以显著下调CYP1A1的表达,提示Kyn水平升高可以激活Ahr,调控Ahr介导的基因表达,CP-25对Ahr介导的转录激活有抑制作用。5. CP-25对Kyn刺激后的MH7A细胞中Ahr和GRK2相互作用的影响激光共聚焦结果显示,和对照组相比,Kyn（200μM）刺激48h后,Ahr发生明显的转核现象,GRK2表达升高,体外给予CP-25后,Ahr转核和GRK2表达均表现为下调。Co-IP结果显示,和对照组相比,Kyn（200μM）刺激48h后,Ahr和GRK2在MH7A细胞中的表达明显升高,体外给予CP-25(10-5mol/L)作用后,可以明显抑制Ahr和GRK2的相互作用。6. 转染Ahr si RNA对MH7A功能的影响CCK-8法结果显示,与对照组相比,Ahr基因干扰后的MH7A增殖反应降低,Transwell小室法检测,发现其迁移能力明显减少。结论:1.与对照组相比,RA患者滑膜组织和AA大鼠关节滑膜中Ahr表达均增加,提示Ahr参与了RA的病理机制。2.CP-25整体给药显著改善AA大鼠的全身和局部关节炎表现,抑制胸腺T细胞、脾脏B细胞增殖反应,降低血清和FLS培养上清中IL-1β的分泌。CP-25可以通过调控Ahr的表达进而抑制AA大鼠FLS的增殖能力。3.Kyn能够促进MH7A细胞的增殖、迁移能力,表明Kyn激活Ahr可能参与了慢性关节滑膜炎症。CP-25通过调控Ahr与GRK2的相互作用进而抑制Ahr的转核和下游通路的激活,抑制FLS的异常活化,可能是其发挥治疗作用的机制之一。