【摘 要】
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目的:研究C-藻蓝蛋白（C-phycocyanin,C-PC）对转化生长因子β1（Transforming growth factor beta 1,TGF-β1）诱导的HeLa细胞增殖、迁移的抑制作用及机制,并通过人类蛋白质组芯片筛选与C-PC相互作用的细胞膜蛋白,为进一步揭示C-PC入胞机制提供理论依据。方法:CCK-8法检测不同浓度（50、100、200、400、800、1600μg/m L
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目的:研究C-藻蓝蛋白（C-phycocyanin,C-PC）对转化生长因子β1（Transforming growth factor beta 1,TGF-β1）诱导的HeLa细胞增殖、迁移的抑制作用及机制,并通过人类蛋白质组芯片筛选与C-PC相互作用的细胞膜蛋白,为进一步揭示C-PC入胞机制提供理论依据。方法:CCK-8法检测不同浓度（50、100、200、400、800、1600μg/m L）C-PC作用24 h和48 h后对HeLa细胞增殖的影响。后续实验分为四组:对照组、TGF-β1处理组、TGF-β1联合C-PC共同处理组、C-PC单独处理组。针对不同实验组处理后HeLa细胞特征进行检测:显微镜观察细胞形态变化;细胞平板克隆实验对HeLa细胞集落形成能力进行检测;细胞划痕愈合实验和Transwell小室法检测HeLa细胞迁移能力;RT-PCR检测HeLa细胞内m RNA Slug、Snail、Zeb1、Twist等迁移相关转录因子的表达;Western Blot对HeLa细胞内Vimentin、E-cadherin、N-cadherin等迁移相关蛋白表达水平进行检测。进一步利用人类蛋白质组芯片,预测和筛选出与C-PC相互作用的细胞膜上受体并分析其功能;免疫荧光实验对从HeLa细胞上筛选出与C-PC相互作用蛋白和C-PC进行共定位,以验证蛋白质芯片的预测结果;利用Pull-down实验,通过带有GST标签的C-PCα与β亚基,将目的蛋白从HeLa细胞总蛋白中筛选并验证。结果:1、CCK-8法检测结果显示,HeLa细胞经C-PC处理24 h及48 h后,细胞增殖活力均受到明显抑制（P<0.05或P<0.01）,且呈浓度依赖性,处理24 h的IC50值为255.4μg/m L,处理48 h的IC50值为387μg/m L,故选择后续实验C-PC的工作时间为24 h,工作浓度浓度为200μg/m L。2、在显微镜下观察细胞形态,对照组HeLa细胞呈现连接紧密的多边形,10 ng/m L TGF-β1处理组HeLa细胞变为迁移能力强的连接松散的长梭形细胞,10 ng/m L TGF-β1+200μg/m L C-PC共同处理组中HeLa细胞呈长梭形细胞的比例下降,多数呈多边形,抑制了TGF-β1诱导的细胞形态变化,而200μg/m L C-PC单独处理组HeLa细胞贴壁能力下降,细胞碎片与死细胞增多。3、细胞平板克隆实验显示,与对照组相比,TGF-β1单独处理组细胞的集落数明显增多,TGF-β1与C-PC共同处理组细胞集落数量较TGF-β1处理组明显下降,200μg/m L C-PC单独处理组形成集落数量受到了明显抑制（均P<0.01）。4、划痕愈合实验和Transwell细胞迁移实验结果均显示,TGF-β1诱导后HeLa细胞迁移能力显著增强,C-PC处理后则抑制了这一现象,并且C-PC单独处理细胞后细胞迁移能力显著降低。5、与对照组相比,TGF-β1处理组中HeLa细胞Slug、Twist、Snail、Zeb1的m RNA表达水平显著升高,而加入C-PC共处理可逆转上述改变（P<0.05或P<0.01）,C-PC单独处理组则显著抑制了这些m RNA的表达。6、Western Blot实验结果显示,TGF-β1处理组HeLa细胞内Vimentin、N-cadherin、ZDHHC5蛋白的表达水平显著高于对照组（P<0.05或P<0.01）,TGF-β1+C-PC共处理组这些蛋白表达水平较TGF-β1处理组明显降低（P<0.05或P<0.01）,C-PC单独处理组内蛋白表达量显著低于对照组（均P<0.05）;而在TGF-β1处理组处理后细胞内E-cadherin的表达水平较对照组显著降低（P<0.01）,E-cadherin表达水平在TGF-β1+C-PC共处理后较TGF-β1处理组明显升高,与对照组相比,C-PC单独处理后则显著提高了该蛋白表达量（P<0.05）。7、通过人类蛋白质组芯片筛选出了HeLa细胞中ITPR3、ZDHHC5、Syntenin三种与C-PC相互作用的细胞蛋白。8、Pull-down实验将ZDHHC5蛋白从HeLa细胞总蛋白中筛选出来,并通过免疫荧光实验证实C-PC与ZDHHC5的结合。结论:C-PC可以显著抑制TGF-β1诱导的HeLa细胞增殖和迁移,C-PC可能通过与细胞膜上受体ZDHHC5蛋白结合实现入胞转运。
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