目前临床上采用联合化疗、放疗和造血干细胞移植的治疗方案使大部分淋巴瘤患者可以达到完全缓解,但肿瘤微小残留病(minimal residual desease,MRD)很难被现行的治疗方案所彻底消灭,因此,MRD 是淋巴瘤复发的根源所在。免疫基因治疗一直被认为是根除 MRD 的理想方法,通过基因修饰的自体白血病/淋巴瘤疫苗增强宿主免疫力,激发机体自身的特异性免疫反应,清除 MRD,有望提高肿瘤的治疗效果,防止复发。我们研究小组的前期研究显示:B7.1、GM-CSF 基因修饰的 EL-4 细胞瘤苗,能有效地激发小鼠抗淋巴瘤免疫反应,且两者具有协同趋势。具有潜在的临床应用价值。本研究拟进一步构建双基因载体、制备表达双基因的瘤苗,即一个载体负载两个目的基因(GM-CSF 和 B7.1 基因),以期通过一次转染、筛选即可完成双基因瘤苗的制备,较简便、实用;并拟进一步提高双基因修饰的 EL-4 细胞CD80的表达率及高分泌GM-CSF因子,以期能达到更好的清除MRD的效果。本研究内容分三个部分:1.单链表达小鼠 GM-CSF 和 B7.1 双基因逆转录病毒载体的构建,病毒上清制备及双基因修饰的 EL-4 淋巴瘤细胞的制备。应用 RT-PCR 方法克隆小鼠 B7.1基因 cDNA 全长编码序列,插入逆转录病毒载体 pLXSN 中。应用 PCR 重叠延伸法,将 mGM-CSF 和 mB7.1 基因的 cDNA 编码序列通过一 linker 序列拼接, 1<WP=5>构建mGM-CSF与mB7.1融合基因mGM-B7.1,将其插入逆转录病毒载体pLXSN中,并进行核苷酸序列测定。通过 Lipofectamine 2000 介导的转染法将逆转录病毒载体 pLXSN 及构建于逆转录病毒载体上的小鼠 GM-CSF、B7.1 基因 cDNA 和mGM-B7.1 融合基因导入包装细胞 PA317 中,经 G418 筛选后获得 G418 抗性的PA317 克隆。收集含复制缺陷型逆转录病毒的 PA317 抗性克隆的培养上清,用NIH3T3 细 胞 测 定 pLXSN 、 pLXSNmGM-CSF 、 pLXSNmB7.1 、 和pLXSNmGM-B7.1 病毒滴度。用逆转录病毒多次重复感染小鼠 T 淋巴瘤细胞系EL-4 , 获 得 基 因 修 饰 的 EL-4/pLXSN 、 EL-4/mGM-CSF 、 EL-4/mB7.1 、EL-4/mGM-B7.1 细胞。用流式细胞仪和 ELISA 方法检测 EL-4、EL-4/pLXSN、EL-4/mGM-CSF、EL-4/mB7.1、EL-4/mGM-B7.1 细胞 CD80 的表达和 GM-CSF的含量。 2.GM-CSF 和 B7.1 双基因修饰的 EL-4 细胞瘤苗的免疫预防和免疫治疗试验。 (1)免疫预防实验:先接种不同次数(一至三次不等)的瘤苗免疫小鼠,再接受 5×104个野生型 EL-4 细胞攻击,观察小鼠有无淋巴瘤生长。(2)免疫基因治疗实验:用丝裂霉素 C 灭活的 EL-4、EL-4/pLXSN、EL-4/mGM-CSF、EL-4/mB7.1、EL-4/mGM-B7.1 细胞注射已用野生型 EL-4 细胞致瘤的 C57BL/6小鼠,观察淋巴瘤生长情况及小鼠存活时间。(3)病理学检查:将经六次瘤苗治疗后的小鼠的淋巴瘤组织做病理学检查。 3.构建单顺反子表达人 GM-CSF 和 B7.1 融合基因真核表达载体。为后续研究人类白血病/淋巴瘤的免疫基因治疗而构建该融合基因表达载体,应用巨引物PCR 技术对人 GM-CSF(hGM-CSF) 基因 cDNA 进行定点突变;应用 PCR 重叠延伸法,将 hGM-CSF 和 hB7.1 基因的 cDNA 编码序列通过一 linker 序列拼接, 2<WP=6>构建 hGM-CSF 与 hB7.1 融合基因 hGM-B7.1,将其插入 pcDNA3 真核表达载体,并进行核苷酸序列测定。 本文主要结果如下: 1.成功构建小鼠 B7.1cDNA 重组逆转录病毒载体,其全长编码序列经测序完全正确。成功构建 mGM-B7.1 融合基因重组逆转录病毒载体,其 mGM-CSF、linker 、 mB7.1 的连接顺序、方向及序列完全正确。EL-4/mB7.1 细胞和EL-4/mGM-B7.1 细胞能高效表达 B7.1(CD80)分子,最高表达分别为 91.54%和 99.33%。EL-4/mGM-CSF 细胞能上调 CD80 的表达,表达率为 38.91%。EL-4/mGM-CSF 细胞产 GM-CSF 量为 138.2pg/1x105/24h,EL-4/mGM-B7.1 细胞产 GM-CSF 量为 72.6pg/1x105/24h。 2. GM-CSF 和 B7.1 双基因修饰的 EL-4 细胞对小鼠淋巴瘤的免疫预防效果。预防接种瘤苗三次后接受野生型 EL-4 细胞(5×104 个)攻击,EL-4/GM-CSF组(每组均为 8 只)有 4 只小鼠、EL-4/B7.1 组有 3 只小鼠、EL-4/GM-B7.1 组有 6 只小鼠长期无瘤生存。预防接种瘤苗二次后接受野生型 EL-4 细胞(5×104个)攻击,EL-4/GM-CSF(每组均为 8 只)组有 4 只小鼠、EL-4/B7.1 组有 2 只小鼠、EL-4/GM-B7.1 组有 5 只小鼠长期无瘤生存。预防接种瘤苗一次后接受野生型 EL-4 细胞(5×104个)攻击,EL-4/GM-CSF 组(每组均为 6 只)有 1 只小鼠、EL-4/GM-B7.1 组有 2 只小鼠长期无瘤生存。以上对照组小鼠,遭受野生型EL-4 细胞攻击后均全部长出淋巴瘤并于观察期(60 天)内死亡。 3. GM-CSF 和 B7.1 双基因修饰的 EL-4 细胞瘤苗的免疫治疗效果。荷瘤小鼠(接种 1×105个野生型 EL-4 细胞)长出肿瘤结节后,予三次瘤苗治疗,治疗组小鼠生存时间仅比对照组延长 3~6 天不等。在小鼠肿瘤负荷少(接种 5×104个野生型 EL-4 细胞)、荷瘤早期(荷瘤第二天)即予瘤苗治疗、瘤苗治疗次数