VEGF反义核酸对胰腺癌增殖及血管生成影响的研究

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胰腺癌在西方发达国家中已成为第五大恶性肿瘤死亡病因,其死亡病例占胃肠道恶性肿瘤死亡病例的20%。尽管随着外科技术的提高,胰腺癌的切除率有了显著的提高,但由于胰腺癌早期诊断的困难、肿瘤本身的侵袭性、早期的淋巴和血行转移以及缺乏有效的系统治疗,胰腺癌的愈后极差。目前胰腺癌的化学治疗主要为针对肿瘤细胞的细胞毒性药物,这些药物对正常细胞亦有毒性,而且由于肿瘤新生物细胞的遗传不稳定性,化疗的同时导致对肿瘤细胞的耐药性选择。1971 年Folkman 首先提出了针对肿瘤血管生成的设想。当肿瘤细胞生长到一定程度时需要新生血管长入以提供营养促进转移。因此,肿瘤的血管化是新生物从小的局限的肿瘤转变为具有转移能力的增大的肿瘤过程中的关键步骤。有研究显示实体瘤如无新生血管长入,瘤体直径将无法超过0.4mm。这一过程中一系列前血管生成因子参与其中,包括bFGF、PDGF、PDEGF、FGF、Angiopoietin-1、TGF-β1、TGF-α、EGF 等。其中血管内皮生长因子(VEGF)是最具特征性的前血管生成因子,对血管内皮细胞的特异性作用在生长因子中具有相对唯一性。针对VEGF 人们采用VEGF 抗体、VEGF-毒素结合体、小分子量VEGF 受体拮抗剂等方法来抑制肿瘤血管生成,而VEGF 反义核酸技术亦被认为是一种有效抑制肿瘤细胞产生VEGF 的基因治疗方法。本研究采用PCR 方法从pcDNA3-VEGF121 中拷贝VEGF121 cDNA 片段,并在其上下游分别引入Eco RⅠ和Bam HⅠ限制性酶切位点。通过双酶切及连接反应将VEGF121 cDNA 反向插入质粒载体pcDNA3 多克隆位点中Bam HⅠ和Eco RⅠ之间,从而成功构建人反义VEGF121 真核表达质粒pcDNA3-ASVEGF121。采用脂质体介导的方法将VEGF121 反义表达质粒转染人胰腺癌细胞系BxPC-3,通过G-418 的筛选获得稳定表达反义VEGF121 的阳性克隆。PCR 方法检测质粒neoRDNA 片段,进行外源质粒整合度的鉴定。结果显示外源质粒已经整合于细胞基因。在肿瘤细胞体外研究中,采用RT-PCR 的方法检测了VEGF121 基因转录水平的变化;ELISA 方法测定培养液上清VEGF 蛋白表达水平的变化。采用免疫组化的方法检测培养细胞表面VEGF、Flk-1、Bcl-2 的表达。通过克隆形成试验、MTT法测定细胞生长曲线检测肿瘤细胞增殖能力。采用Annexin Ⅴ-FITC 和PI 双标记以流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡情况。通过测定ECV-304 生长曲线,研究了肿瘤细胞上清对血管内皮细胞增殖的影响。通过体外血管生成试验,研究了培养液上清的体外促血管生成活性。肿瘤细胞体外研究结果显示,VEGF121 反义表达质粒能显著抑制胰腺癌细胞VEGF121 mRNA 的表达,且培养液上清中VEGF 蛋白水平受到明显抑制。免疫组<WP=5>化显示VEGF 反义核酸对细胞表面的VEGF 也有明显的抑制作用,而VEGF 受体-Flk-1 的表达显著上升。Pearson 相关性分析显示VEGF 阳性率与Flk-1 阳性率呈明显的负相关(P=0.017)。研究发现抑制胰腺癌细胞VEGF 的表达能降低细胞Bcl-2 的表达。但两者相关性无统计学意义(P=0.074)。克隆形成试验显示转染反义表达质粒的胰腺癌细胞克隆形成率明显降低,生长曲线测定显示细胞生长受到显著抑制。表明VEGF 反义核酸能抑制胰腺癌的单细胞增殖能力,降低肿瘤细胞的独立生存能力及对生存环境的适应性。Annexin Ⅴ-FITC 和PI 双标记流式细胞仪检测凋亡结果显示VEGF 反义核酸能促进肿瘤细胞的凋亡。通过测定ECV-304生长曲线,显示肿瘤细胞培养液上清促血管内皮细胞生长作用受到明显的抑制。体外血管生成试验显示培养液上清的体外促血管生成活性受到显著抑制。通过BxPC-3 胰腺癌细胞皮下注射的方法,我们成功建立了胰腺癌裸鼠移植瘤模型,并研究了VEGF 反义核酸对胰腺癌细胞在裸鼠体内增殖的影响及移植瘤血管生成的变化。在体内研究中,我们观察了移植瘤体积的变化。裸鼠处死后,称取移植瘤的重量。瘤体行病理切片,免疫组化染色检测VEGF、Flk-1、Bcl-2表达变化。HE 染色观察移植瘤血管生成情况,并行血管内皮细胞特异性Ⅷ因子相关抗原的免疫组化染色。采用IHS 评分判定VEGF、Flk-1、Bcl-2 表达水平,测定移植瘤微血管密度(MVD)。体内研究结果显示,转染VEGF121 反义表达质粒的胰腺癌裸鼠移植瘤生长缓慢,体积最小,最大直径不超过5mm。免疫组化显示移植瘤VEGF、Flk-1、Bcl-2的表达变化与体外培养条件下类似,即转染反义表达质粒的移植瘤VEGF、Bcl-2表达受抑制,Flk-1 表达水平上升。常规HE 染色显示,转染VEGF121 反义表达质粒的胰腺癌裸鼠移植瘤包膜下缺乏血管结构,瘤体内亦缺乏明显的血管结构及结缔组织。而对照组具有丰富的血管结构,尤其以瘤体包膜下及肿瘤结缔组织内最为丰富。血管内皮细胞特异性Ⅷ因子相关抗原的免疫组化染色显示对照组瘤体包膜下及肿瘤结缔组织内有丰富的棕黄色阳性染色的血管内皮细胞。而转染反义表达质粒的移植瘤则缺乏阳性染色的血管内皮细胞,微血管密度显著下降。总之,研究揭示VEGF 反义核
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