美拉德反应中羧甲基赖氨酸和羧乙基赖氨酸的形成及调控机理的研究

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晚期糖基化终末产物(Advanced Glycation End-products,AGEs)是蛋白质、氨基酸、脂类或核酸等物质的游离氨基与还原糖的羰基经过缩合、重排、裂解及氧化修饰等一系列反应后形成的一类稳定的终末产物的总称。食源性AGEs是人体内AGEs的重要来源,过量摄入高AGEs水平的膳食会增加炎症和氧化应激反应,诱发糖尿病及其并发症等。因此,食品加工中羧甲基赖氨酸(CML)和羧乙基赖氨酸(CEL)等AGEs的调控对确保食品安全具有重要意义。本研究采用高效阴离子交换色谱法开发了一种具有高分离度、能快速高效同时检测美拉德反应中CML和CEL的新方法,为后续CML和CEL形成规律的研究提供了重要的技术手段。本文系统地研究了pH、糖的种类、金属离子、亚硫酸盐及糖蜜抗氧化活性物质等外部环境改变对美拉德反应体系中CML和CEL形成的影响,通过监控反应底物和中间产物等的变化,提出了CML和CEL的调控机理。基于高效阴离子交换原理,开发了一种快速高效同时检测美拉德反应中CML和CEL的高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测(HPAEC-PAD)法。该方法具有成本低、操作简便和分离度高等特点,CML和CEL在3.125-25 mg/L具有良好的线性关系(R2>0.997),其适用于实验室中CML和CEL的常规分析,该方法的建立为后续CML和CEL形成规律的研究提供了重要的技术手段。以葡萄糖和赖氨酸模型反应体系为研究对象,分别研究不同pH(4.92,5.91,6.98,8.04和9.18)和不同加热时间(0-4 h)对CML和CEL形成的影响。实验结果表明pH和加热时间对CML和CEL的形成影响很大。美拉德反应体系中CML和CEL在加热初期(0.5 h)即大量形成,而随着加热继续进行(0.5-4 h),CML和CEL含量变化不大。此外,酸性条件下生成的丙酮醛(MGO)和乙二醛(GO)含量低于碱性条件,从而导致低p H下形成的CML和CEL更少。因而短时、偏酸性的加工工艺有利于CML和CML的抑制。以酸性糖葡萄糖醛酸内脂和碱性糖氨基葡萄糖为原料和赖氨酸反应,对照组为葡萄糖-赖氨酸反应体系,采用HPAEC-PAD检测体系中反应底物糖和赖氨酸的变化,并进一步采用高效液相色谱-二极管阵列(HPLC-DAD)检测二羰基化合物GO和MGO的邻苯二胺衍生物的含量变化,提出酸性糖和碱性糖对CML和CEL的作用机制。实验结果表明酸性糖和碱性糖显著抑制了美拉德反应中cml和cel的形成,且酸性糖、中性糖(葡萄糖)和碱性糖体系中的色值差别不大。特别是以酸性糖为原料能显著抑制体系中cel的形成,而以碱性糖为原料对cml抑制效果最好,该体系中形成的go含量较低,且氨基葡萄糖不能与赖氨酸反应生成阿玛多利重排产物进而氧化形成cml,造成氨基葡萄糖-赖氨酸体系中检测不到cml的存在。酸性糖对cml的形成也有明显的抑制作用,该体系中形成的阿玛多利重排产物不稳定,容易经逆反应变回葡萄糖醛酸和赖氨酸,从而通过阿玛多利重排产物氧化裂解形成的cml也少。因此,采用酸性糖和碱性糖代替中性糖为原料,不仅对体系色值影响较小,还能抑制体系中cml和cel的形成。以葡萄糖和赖氨酸模型反应体系为研究对象,研究了不同浓度ca2+和mg2+(0,50,100,150和200mmol/l)对cml和cel形成的影响,发现ca2+和mg2+对cml和cel的形成均有明显的抑制效果,且ca2+的抑制效果强于mg2+。特别是当ca2+浓度为200mmol/l,体系中已检测不到cel的存在。这可能是由于ca2+和mg2+能与阿玛多利重排产物形成复合物,抑制了cel和cml前体物mgo和go的形成造成的。此外,ca2+和mg2+的加入也能降低模型反应体系的褐变程度。因此,ca2+和mg2+的加入对于体系中有害产物的减少以及褐变程度的控制均有一定作用。从cml和cel两种有害产物的角度研究了亚硫酸盐在食品中的安全性问题,2-(0,20,40,100和200葡萄糖和赖氨酸模型反应体系中分别加入不同浓度so3mmol/l),发现由于亚硫酸盐具有还原性,能抑制通过氧化反应产生的go的形成。而亚硫酸盐的亲核作用则促进了非氧化路径下产生的mgo的形成。亚硫酸盐的加入显著增加了体系中cel的含量,这是由于亚硫酸盐促进了其前体物mgo的形成造成的。此外,低浓度亚硫酸盐对cml的形成具有促进作用,而高浓度亚硫酸盐由于能与葡萄糖和二羰基化合物中的羰基发生反应进而减少了go和阿玛多利重排产物的含量,从而抑制了以其为前体物的cml的形成。糖蜜经提取后测定其总酚含量,发现其总酚含量较高,为25.5mg没食子酸当量/g提取物。糖蜜提取物具有较强的抗氧化活性,能有效清除dpph自由基。糖蜜乙酸乙酯相提取物和正丁醇相提取物由于具有较强的抗氧化活性,能抑制反应体系中氧化反应的进行,且能与mgo、go等二羰基化合物发生反应生成加合物,造成体系中MGO和GO含量减少,进而抑制了以MGO和GO为前体物的CEL和CML的形成。糖蜜中大量含有的香草酸和丁香酸对于CML和CEL的形成也具有抑制作用。因此,制糖工业副产品糖蜜作为添加剂应用于美拉德反应中CML和CEL的抑制是理论可行的。
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