论文部分内容阅读
环境中非生物胁迫因素,如干旱、盐、低温、盐碱等严重影响紫花苜蓿生长发育和品质。培育抗逆性品种已经成为亟待解决的问题。CIPK是植物中一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在植物响应逆境胁迫中发挥着重要的作用。它能够与钙离子感应蛋白CBL相互作用,启动细胞内相关应答基因来应对胁迫。本研究从紫花苜蓿中克隆得到的MsCIPK8基因,属于CIPK家族。通过MsCIPK8对烟草的遗传转化,获得转基因植株。分析MsCIPK8基因在植物抗盐、盐碱方面的功能,并为紫花苜蓿遗传育种贮备优异基因资源。主要研究结果如下:1.在盐碱胁迫下紫花苜蓿转录组测序分析表明,MsCIPK8受到盐碱胁迫诱导表达量上调,根据该测序结果设计克隆引物,克隆获得MsCIPK8基因。该基因CDS全长1341 bp,编码由446个氨基酸残基组成的亲水性蛋白,没有跨膜结构域。MsCIPK8蛋白的二级结构为:无规则卷曲占46.64%,α-螺旋占34.75%,延伸链所占比例是18.61%。系统进化分析表明,紫花苜蓿MsCIPK8与蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)MtCIPK8亲缘关系最近,两个蛋白序列比对发现存在4个差异位点,其中3个在保守结构域内。2.MsCIPK8在紫花苜蓿根、茎、叶、花、种子中均有表达,其中在根中最高,在种子中最低。MsCIPK8基因的表达受到低温、干旱、盐和盐碱胁迫诱导,并且随着胁迫处理时间的不同发生相应的变化。低温胁迫下,MsCIPK8在根和叶中的表达量分别在12h和3h达到峰值;盐胁迫下,MsCIPK8在根中的表达量12h达到峰值;盐碱胁迫下,根和叶中MsCIPK8的表达量均在24 h达到峰值;干旱胁迫下,MsCIPK8在根和叶中的表达量均在12 h达到峰值。3.将MsCIPK8基因与表达载体pCBM连接,并命名为pCBM-MsCIPK8。该载体含有CaMV35S启动子和抗性筛选基因草丁膦(PPT)。利用冻融法将连接好的载体导入农杆菌中,转化烟草。通过抗性筛选、PCR和qRT-PCR检测,共获得16个阳性株系,qRT-PCR结果显示,其中16号、18号和28号株系中目的基因MsCIPK8的表达量最高。4.对转MsCIPK8基因烟草进行300 mmol/L NaCl和30 mmol/L NaHCO3处理下的打孔表型实验。结果显示,转MsCIPK8烟草叶片黄化程度比野生型低,叶绿素含量比野生型高。盐和盐碱碱胁迫处理之后,转MsCIPK8烟草中的MDA、O2-和H2O2含量均显著低于野生型,转MsCIPK8烟草中可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸含量均显著高于野生型,抗氧化物酶酶活也很大程度上高于野生型。以上结果表明,MsCIPK8基因对抗盐和抗盐碱胁迫具有重要作用。