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犬流感(Canine influenza,CI)是由正粘病毒科流感病毒属A型流感病毒引起的犬呼吸道传染病。A型流感病毒的感染谱较广,可感染人、马、猪和禽类等多种动物。犬流感病毒(CIV)主要通过空气传播,但经消化道或通过接触病毒污染的各种物品也是重要的传播途径。过去一般认为犬不是A型流感病毒的易感动物,但近十多年来已陆续发现犬可被不同亚型的流感病毒所感染,患犬常出现喷嚏、咳嗽、发热和流涕等临床症状,死亡率为1%～5%。目前,犬流感病毒H3N2亚型在中国、韩国等亚洲国家及北美地区广泛流行,流感病毒已被证实可突破种间屏障,感染异种动物。犬作为人类的伴侣动物,与人类接触密切,目前虽尚未确认犬流感病毒是否感染人类及其他哺乳动物,但建立一种高效便捷的检测方法依然具有重要的公共卫生意义。现阶段检测CIV的方法包括病毒分离、琼脂扩散(AGP)试验、荧光抗体试验、血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验、核酸探针技术和RT-PCR检测等。相对于这些方法来说,ELISA检测法更为简便,灵敏度和特异性更高;ELISA检测的成本较低,并可同时检测大量样品。本研究旨在制备抗犬流感病毒的单克隆抗体,建立CIV夹心ELISA检测法,为CIV的快速检测和诊断提供有价值的参考。试验一、犬流感病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立用纯化CIV抗原免疫BALB/c小鼠,将制备的脾细胞与状态良好的SP2/0骨髓瘤细胞融合,获得2株能稳定分泌抗CIV单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞株,将其命名为1F12和2A3,抗体亚类皆为IgM,将2株杂交瘤细胞分别注入小鼠腹腔,产生的抗体效价可分别达105和106。间接ELISA检测表明,2株单克隆抗体与其他多种病毒间无特异性反应;间接免疫荧光试验(IFA)证明,2株单抗均与CIV发生特异性反应;免疫印迹(western blot)分析发现,2株单克隆抗体均与CIV产生特异性蛋白条带。血凝抑制试验(HI)显示1F12腹水血凝效价为210,2A3无血凝效价。病毒中和试验显示,1F12的中和效价为12800,2A3无中和活性。试验二、犬流感病毒单克隆抗体夹心ELISA检测法的建立将单克隆抗体IF12用辣根过氧化物酶标记,作为酶标抗体,单克隆抗体2A3纯化后,作为包被抗体,建立CIV双抗体夹心ELISA检测法。试验结果表明,建立的双抗体夹心ELISA检测法特异性较好,与其他多种病毒间无交叉反应;将不同批次ELISA板条实施重复性检测,批间变异系数≤9.3%。用该法与RT-PCR法对34份临床样品进行检测,23份样品为阳性,11份为阴性,检测结果一致。本试验建立的双抗体夹心ELISA检测法有较好的特异性、敏感性和可重复性,可用于临床CIV诊断和检测。