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生松素是植物苯丙烷类代谢途径中重要的二氢黄酮类化合物,具有良好的生物活性。其广泛存在于植物中,但是植物提取法制备生松素具有纯化工艺复杂和环境破坏等缺点,限制了其广泛的应用。本文以大肠杆菌为宿主菌,利用多质粒表达系统构建了葡萄糖至生松素的合成途径。考察了以葡萄糖为底物的单菌发酵和混菌发酵对生松素合成的影响,此外,还考察了改造丙二酰辅酶A途径对生松素合成的影响。主要研究结果如下:(1)选择了来自于玉米的苯丙氨酸解氨酶(PAL),来自于水稻的4-香豆酰辅酶A连接酶(4CL),来自于矮牵牛的查尔酮合成酶(CHS)和来自于紫苜蓿的查尔酮异构酶(CHI),构建了苯丙氨酸至生松素的合成途径,将该途径导入到能利用葡萄糖生产苯丙氨酸的工程菌株E.coli phe01中,得到了能直接以葡萄糖为底物合成生松素的工程菌株E.coli phe03。E.coli phe03发酵48 h检测到生松素的含量为1.39 mg/L。(2)从葡萄糖至生松素这个冗长的合成途径不仅给菌株带来了代谢负担,而且不利于调控途径中酶的表达,选择混菌发酵的模式可以缓解这些问题。首先构建了分别以苯丙氨酸和肉桂酸为底物合成生松素的重组菌E.coli BL4和E.coli BL3,发酵结果显示肉桂酸的过量积累限制了生松素的合成。其次构建了表达PAL的菌株E.coli phe04。最后选择了两种不同的混菌发酵组合(E.coli phe01和E.coli BL4;E.coli phe04和E.coli BL3),合成的生松素的产量分别是5.57 mg/L和6.48 mg/L。(3)本论文采取了两种提高胞内丙二酰辅酶A含量的方法。一方面是通过添加浅蓝菌素抑制脂肪酸合成途径。以E.coli BL3为例,通过添加不同浓度的浅蓝菌素发现其最适添加量为20μM,生松素的产量最高(20.28 mg/L);添加的浓度越高,对菌株生长的抑制越明显,生松素的产量不再提高。另一方面是将来源于三叶草根瘤菌的丙二酰辅酶A途径(MatB和MatC基因)引入大肠杆菌E.coli BL3中,得到了重组菌株E.coli BL32。在不添加和添加2 g/L丙二酸钠的条件下得到的生松素产量分别是0.66 mg/L和4.35 mg/L,结果显示其具备转化丙二酸钠合成丙二酰辅酶A的能力。但是,通过与E.coli BL3合成的生松素产量比较,发现E.coli BL32合成生松素的能力下降。荧光定量PCR实验结果显示,在菌株E.coli BL3中的4CL和CHS的转录水平分别是E.coli BL32中的2.32和3.02倍,表明MatB和MatC的过表达导致了E.coli BL32中4CL和CHS的转录水平降低,这可能导致了肉桂酸的消耗量减少和生松素的生成量减少。