重组运动发酵单胞菌合成培养基的优化及recG基因过表达菌株的构建

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运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)由于其高效的乙醇发酵性能和独特的代谢途径,其在乙醇发酵工业被认为具有广阔的应用前景。但目前没有适合重组运动发酵单胞菌生长和产醇的合成培养基,而且多数重组菌对于乙酸等纤维素水解液抑制因子的耐受性较低。本研究首先利用统计学方法优化了重组运动发酵单胞菌的合成培养基,构建了含有E.coli和Z.mobilis的recG基因的质粒并在该菌和野生菌中进行表达,并用优化的合成培养基进行了初步的发酵评价。通过一系列统计学实验设计方法对木糖发酵Z.mobilis乙醇生产的合成培养基组分进行了优化。首先利用Plackett-Burman实验对19种培养基组分进行了筛选,确定影响乙醇生产的八种组分分别为木糖、(NH42SO4、柠檬酸钠、琥珀酸、氯化胆碱、叶酸、维生素B6和硫胺素。随后用最陡爬坡实验确定五个成分(木糖、柠檬酸钠、氯化胆碱、维生素B6和硫胺素)的最大相应区域。之后用响应面方法(RSM)对这五种组分进行优化,建立了以乙醇为目标函数的数学模型。模型的方差分析(ANOVA)表明木糖和柠檬酸钠对重组Z.mobilis的乙醇生产有显著影响。且当柠檬酸钠浓度在0.1-1.6g/L范围内时,生物量和乙醇的生产与柠檬酸钠浓度的对数值呈很好的线性关系。验证实验证实了模型的有效性,优化的合成培养基中的乙醇产量为19.1g/L,比RM中(17.9g/L)提高了6.7%。对RSM优化的合成培养基进行简化,获得的最终培养基S2组分为:木糖58.5g/L,柠檬酸钠2.65g/L,(NH42SO41g/L,MgSO4·7H2O1g/L, KH2PO42g/L,泛酸钙2.74mg/L。S2中的乙醇产量达到21.7g/L,比RM培养基中的乙醇产量(17.9g/L)提高20.7%。优化的合成培养基适于重组菌的生长和产醇,且组份明确,能精确定量,适用于分析营养、代谢和生物测定等对定量有要求的研究。为了获得能够在含有乙酸等抑制因子的纤维素水解液中高效产醇的重组Z.mobilis,我们构建了携带Pgap启动子、rrnB终止子和E. coli或Z. mobilis的recG基因的质粒pBBR1-MCS2-Pgap-ErecG-rrnB和pBBR1-MCS2-Pgap-ZmrecG-rrnB。通过电转化获得含有pBBR1-MCS2-Pgap-ErecG-rrnB质粒转化子CP4(ErecG)和CP4(X, ErecG)及含有pBBR1-MCS2-Pgap-ZmrecG-rrnB质粒的转化子CP4(ZmrecG),并对其进行了初步的发酵评价。为后续的重组菌株的功能研究以揭示recG基因在提高抑制因子耐受性方面的作用奠定了基础。
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