论文部分内容阅读
犬瘟热(Canine distemper,CD)是一种由犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)感染引起食肉科动物高发病率和高死亡率的传染病。CDV是副粘病毒科麻疹病毒属的成员。临床上,感染的动物通常表现为发热、厌食、流鼻涕、结膜炎和腹泻等症状,有的还会出现角化过度和中枢神经系统症状,会导致机体淋巴细胞减少和急性期淋巴细胞增殖抑制。由CDV引起的疾病已有数百年的历史,其自然宿主已由传统的犬科、浣熊科和鼬科扩大到猫科、灵猫科等所有陆地食肉科动物,此外偶蹄目、海豹和非人灵长类也被报道能自然感染CDV。尽管活疫苗已经有效地降低了疾病的发病率,但在兽医学上,高度传染性的CD仍是备受关注的重要传染病。目前,一般使用犬肾小管上皮细胞(Madin-Darby Canine Kidney cell,MDCK)或非洲绿猴肾细胞(Africagreen monkey kidney cell,Vero)传代细胞系(细胞膜上缺少CDV病毒受体)分离培养该病毒,但这种分离效果并不理想,导致人们对CDV的病原学与免疫研究发展相对缓慢。因此,通过检测广东地区当前流行的CDV野毒株,分析野毒株和疫苗毒株血凝素蛋白(Haemagglutinin protein,H)特性和差异;构建对CDV高敏感性的细胞系;构建犬N1ICD(Notch1 Intracellular domain of Notch,N1ICD)基因真核表达载体,为研究CDV与Notch信号通路的相互作用提供工具。本研究对日后深入研究CDV的遗传进化、致病机制、治疗方案等具有重要意义,对预防控制国内CD疫情蔓延具有重要现实意义。本研究要开展了以下三个方面的工作。第一,从临床样本中检测野毒株CDV,扩增其H基因,并进行遗传特征分析。第二,构建CDV受体信号淋巴激活分子(Signaling lymphocyte activation molecule,SLAM)真核表达质粒PWPI-SLAM,该质粒含有能表达绿色荧光蛋白EGFP标签的基因。利用慢病毒将表达SLAM受体的基因导入到MDCK中,通过有限稀释法筛选出绿色荧光蛋白标记的MDCK阳性细胞——MDCK-SLAM。通过RT-PCR、间接免疫荧光和Western Blotting方法进行鉴定,检测MDCK-SLAM细胞系能否转录或翻译SLAM基因。第三,从犬外周淋巴细胞cDNA中扩增出犬N1ICD基因片段,构建p3×FLAG-CMV10和EGFP-N1真核载体。本研究结果如下:1.收集临床上含7株CDV野毒株的临床样本,对这些毒株的H基因序列分析发现:与传统疫苗株相比,广东省流行株H蛋白同源性仅为89.3%~91.8%;疫苗株H蛋白有4~7个天冬酰胺糖基化位点,而野毒株已经进化形成9个天冬酰胺糖基化位点。H基因序列的多样性可能影响CDV的细胞趋向性和组织嗜型,从而决定了病毒在机体内的分布、发病进程和临床症状。2.有限稀释法筛选出的MDCK-SLAM细胞,绿色荧光表达率高且荧光强,多次传代后细胞形状和状态无变化,能稳定表达SLAM受体,并且锚定在细胞膜表面。该敏感细胞在接种弱毒疫苗CDV-11 36 h~48 h后就能出现典型细胞病变——合胞体,大大缩短病毒分离时间和提高分离率,将有力推动对CDV病原学研究。3.本研究首次克隆获得犬N1ICD基因,序列长度为2 469 bp,编码822个氨基酸,蛋白质分子质量为87.3 kDa。成功构建了p3×FLAG-CMV10-N1ICD和EGFP-N1ICD真核表达载体,为进一步研究Notch信号通路与犬传染性疾病之间的相互作用奠定基础。