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BMP—7(bone morphogenetic protein—7，BMP—7)是1990年克隆得到的骨细胞因子，能诱导间充质细胞向软骨细胞、成骨细胞分化，异位诱导软骨和骨的形成。研究表明BMP—7能促进牙髓细胞分化，诱导修复性牙本质形成，是一种良好的、促进牙本质再生的生物盖髓剂。但BMPs生物半衰期短、降解速度快、在缺损区难保持足够时间的生物活性，限制其在临床中的应用。因此如何能使BMPs持续、适量地释放是目前亟待解决的关键问题。基因治疗为BMPs的应用提供新的思路。本课题组前期研究曾将腺病毒(adenovirus，Ad)作为BMP—7载体转入人牙髓细胞(human dental pulp cells，hDPCs)，发现转染后的hDPCs能成功表达BMP—7蛋白并能诱导hDPCs分化。然而Ad载体在表达目的蛋白的同时表达病毒衣壳蛋白，引发机体的炎症和免疫应答，其安全性成为人们担忧的隐患。腺相关病毒(adeno—associated virus，AAV)以其免疫原性小、安全性好、无致病性等优点成为基因治疗的新型载体，逐渐受到学者的关注。AAV载体已广泛用于各种组织的基因治疗，如骨组织、心肌组织等。目前已发现的AAV至少有8种，其中最常用的类型有AAV2型与AAV2/1型。不同类型的AAV由于衣壳蛋白的不同对细胞具有不同的亲和性。AAV2与AAV2/1中哪种类型更适合hDPCs的基因治疗，目前无相关研究报道。本实验分别将带有绿色荧光蛋白基因的rAAV载体(recombinant adeno—associated virus—mediated enhanced green fluorescent protein，rAAV—EGFP) rAAV2-EGFP、rAAV2/1-EGFP转染hDPCs，通过比较两者在hDPCs中的转染效率，选择较合适载体；构建带有目的基因hBMP—7的AAV载体，转入hDPCs，Western blot检测转染后hDPCs hBMP—7的表达；观察rAAV—hBMP—7转染后hDPCs的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性以及牙本质涎磷蛋白(dentin sialoprotein，DSPP)、骨钙素(osteocalcin，OCN) mRNA表达，探讨rAAV—hBMP—7转染对hDPCs分化的调节作用，为活髓保存的基因治疗提供实验基础。
目的：
比较rAAV2-EGFP和rAAV2/1-EGFP对hDPCs的转染效率及病毒转染对hDPCs的毒性，筛选转染hDPCs的较合适载体；构建rAAV—hBMP—7并制备重组病毒液；检测经rAAV—hBMP—7转染后hDPCs hBMP—7蛋白的表达，研究hBMP—7基因转染对hDPCs分化的调节作用，为进一步开展活髓保存治疗的体外及临床研究提供实验依据。
研究方法：
①采用酶消化组织块法培养hDPCs并鉴定组织来源；②将rAAV2-EGFP、rAAV2/1-EGFP按感染复数(multiple of infection，MOI)104、105、5×105转染第2代hDPCs，转染后48h免疫荧光显微镜观察各组绿色荧光蛋白表达情况，确定rAAV转染hDPCs的最适MOI值；流式细胞仪检测转染后7d rAAV2-EGFP和rAAV2/1-EGFP在hDPCs中的转染效率；MTT法检测rAAV2-EGFP、rAAV2/1-EGFP按最适MOI值转染hDPCs后4d、6d、8d、10d、12d的增殖活性；③构建rAAV—hBMP—7载体；④Western blot检测rAAV—hBMP—7转染后7d、14d和21d hDPCs中hBMP—7蛋白的表达；⑤碱性磷酸酶活性检测与茜素红矿化结节染色检测rAAV—hBMP—7转染后hDPCs体外矿化能力；Realtime—PCR检测DSPP、OCN mRNA的表达，观察rAAV—hBMP—7转染后hDPCs分化的生物学特性。
结果：
①酶消化组织块法可有效进行hDPCs的原代培养。免疫细胞化学显示所获得的细胞均为抗波形丝蛋白染色阳性，抗角蛋白染色阴性；②rAAV2-EGFP、rAAV2/1-EGFP转染hDPCs后48h荧光显微镜下观察，EGFP的表达数随着MOI值的增加而增高，当MOI值为104，105，5×105时rAAV2-EGFP转染hDPCs48h的转染率分别为(42.33±3.42)％、(67.58±0.99)％、(73.46±1.36)％；rAAV2/1-EGFP转染转染率分别为(13.63±0.91)％、(34.9±0.678)％、(43.8±1.48)％；rAAV2-EGFP的转染效率在各MOI值均较rAAV2/1-EGFP高；按MOI值为105转染hDPCs后7d流式细胞仪检测rAAV2-EGFP、rAAV2/1-EGFP转染率分别为87.6％、35.8％；rAAV2-EGFP、rAAV2/1-EGFP转染细胞后细胞生长正常，MTT结果显示转染后两转染组与未转染组在各时间点吸光度值差异无统计学意义(P>0.05)；③成功构建rAAV2-hBMP—7，其滴度为5×1021v．g/ml；④Western blot结果显示rAAV2-hBMP—7转染hDPCs后能成功表达hBMP—7，转染后7d蛋白表达量最高，随着时间的延长蛋白表达量逐渐降低，但在21d仍有hBMP—7蛋白表达；⑤ALP活性检测结果显示，rAAV2-hBMP—7转染hDPCs后ALP活性逐渐增强，且呈时间依赖性。转染后4d、7d、10d、14d rAAV2-hBMP—7组与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.01)，rAAV2-EGFP组在各时间点与对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。茜素红染色结果显示转染后的hDPCs连续培养14d有矿化结节形成，表明rAAV2-hBMP—7转染后的hDPCs具有矿化能力；⑥Real—time PCR结果显示，rAAV2-hBMP—7组在转染后7d、14d DSPP、OCN mRNA表达量均较rAAV2-EGFP组上调，差异具有统计学意义(P<0.05)。转染后7d，DSPP、OCNmRNA表达量增加显著(P<0.01)，随着时间延长mRNA表达量逐渐降低，转染后21d仍可以检测到DSPP、OCN mRNA表达，但与对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)，因此rAAV2-hBMP—7转染hDPCs后能够诱导hDPCs分化。
结论：
rAAV可以转染hDPCs并获得较高的转染效率；rAAV2-EGFP对体外培养的hDPCs转染效率高于rAAV2/1-EGFP，是转染hDPCs较适合的载体；成功构建并获得滴度为5×1011v．g/ml的rAAV2-hBMP—7。rAAV2-hBMP—7转染hDPCs后能成功表达hBMP—7并诱导hDPCs分化，为BMP—7后期的基因治疗奠定实验基础。