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Ⅵ型分泌系统(Type Ⅵ secretion systerm,T6SS)是2006年才被正式确认和命名的广泛分布于革兰氏阴性细菌中的一种分泌系统。细菌的T6SS多与细菌间竞争和细菌致病性有关,通过T6SS分泌的具有蛋白酶、磷脂酶、肽聚糖水解酶及核酸酶活性的效应分子不仅能直接作用于原核细胞,还能作用于真核细胞。编码T6SS蛋白组分的基因簇平均长度在20kb,通常是由13个连续的核心基因(tssA-tssM)及一些菌株特异性辅助基因组成。这些基因编码的蛋白形成贯穿细菌的“内膜-周质间隙-外膜”注射器状的跨膜结构装置,以类似噬菌体注射效应因子到宿主细胞的形式分泌效应蛋白到靶细胞。TssK蛋白作为T6SS装置的一个重要核心元件,在T6SS装置组装和分泌效应因子过程中发挥重要作用。为了明确TssK在Ⅵ型分泌系统中的作用机制,本研究以Serratia marcescens FS14的总DNA为模板,通过PCR的方法扩增出了tssK基因,并在E.coli C43(DE3)中成功地异源表达了 TssK蛋白,然后用Ni-NTA亲和层析和凝胶过滤层析的方法分离纯化TssK蛋白。将纯化得到的TssK蛋白浓缩到5 mg/mL,运用座滴气相扩散的方法筛选结晶条件,在4℃培养条件下,初筛获得了多个TssK结晶条件。经过正交筛选、additive试剂盒以及改变晶体的培养温度等结晶条件的优化,最终在 10℃,结晶母液为 0.2 MLi2SO4,0.1 MADA pH 6.75,12%PEG4000,2%v/v 2-Propanol,0.2 M Tri-Sodium Citrate的培养条件下获得了高质量的TssK晶体,经X-ray衍射收集到了 2.5 A的完整的衍射数据。由于TssK与蛋白质数据库(PDB)中已经解析结构的蛋白序列同源性很低(<7%),无法通过分子置换方法解析其三维结构。为了解析其相位,我们采用代谢抑制的方法制备了硒代甲硫氨酸TssK衍生蛋白,并获得衍射能力较强的晶体,经X-ray衍射收集到了 2.97A的衍射数据,通过Se-SAD的方法成功确定了 TssK蛋白的相位,解析了TssK蛋白的晶体结构。TssK蛋白晶体的空间群为P6522,每个不对称单元中含有3个TssK蛋白分子。每个TssK单体分子由3个不同的结构域组成,N端结构域包含N端第3-191位氨基酸残基,由3个α-螺旋和9个β-折叠组成;中间结构域(192-313)主要包含4个较长的α-螺旋组成的螺旋束;C端结构域(314-444)由3个α-螺旋以及8个由两组(β10,β12,β14-15,β17和β11,β13,β16)反向平行的β-折叠构成。这三个蛋白分子依靠多个分子间氢键和盐键紧密地相互作用形成稳定的三聚体,其中N端结构域的三聚体交叉在一起形成三棱锥结构;中间结构域由每个单体分子提供4个α-螺旋形成一个由12个α-螺旋组成的螺旋束;C端结构域的构象可变性相对较大,这可能是中间结构域与C端结构域联结处柔性较强,从而使C端结构域向不同方向延伸。为了研究TssK蛋白及其不同结构域在T6SS的作用机制,本研究构建了沙雷氏菌FS14 tssK基因的缺失突变株(FS14Δ tssK)、tssK全长基因回补株(FS14ΔtssK+pWDX-tssK)和编码肽段TssKN313的基因回补株(FS14AtssK+pWDX-tssKN313)。采用免疫印迹的方法分析发现,野生型、突变株以及各个回补菌株细胞内T6SS的标志性蛋白Hcp的表达量基本相同,这说明缺失了tssK后并不影响Hcp在菌体内的转录表达。然而,缺失了tssK基因的沙雷氏菌FS14完全不能向胞外分泌Hcp,而回补了含有TssK全长基因的表达质粒的互补菌株,Hcp的分泌基本可以恢复至野生型的分泌水平,这说明TssK对VI型分泌系统Hcp的分泌至关重要;而回补菌株FS14ΔtssK+pWDX-tssKN313的Hcp分泌水平只能得到部分恢复,具体原因还有待进一步研究。