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在课题组前期工作中,我们通过噬菌体展示技术获得与人高转移前列腺癌细胞系PC-3M特异性结合的短肽B04,继而反向钓取筛选获得PC-3M细胞膜上与B04特异性结合的目标蛋白ATP5B[1]。ATP5B通常表达于线粒体内膜,在某些细胞中可以异位表达于细胞膜,其功能和异位途经尚不明确,且ATP5B的异位表达与肿瘤的转移能力有相关联系。因此,为阐明肿瘤细胞膜表面ATP5B的具体来源并有效抑制ATP5B的异位表达,本研究拟采用特异性ATP5B配体短肽B04,通过脂质体被细胞摄取的独特机制,建立一种使短肽B04只与线粒体ATP5B结合而不与细胞膜ATP5B结合的方法,特异性封闭线粒体ATP5B,通过蛋白印迹法观察细胞膜表面ATP5B异位表达是否有效下降,从而抑制ATP5B的异位表达。方法:1.制备短肽B04并验证其是否具备噬菌体表面同序列短肽相同的功能根据短肽序列合成一批短肽B04,将制得B04与PC-3M细胞共孵育,通过细胞免疫荧光化学以及蛋白印迹法检测B04与ATP5B的结合能力。2.制备包裹短肽B04的脂质体并建立B04的HPLC检测方法（1）通过逆相蒸发法制备包裹B04的脂质体,并使用HPLC建立短肽B04的标准曲线。（2）使用HPLC检测制得脂质体的总药物浓度及游离药物浓度,计算包封率。3.检测B04脂质体对线粒体ATP合酶异位及对PC-3M转移的抑制能力（1）通过ATP生物检测试剂盒检测B04脂质体对细胞内线粒体上ATP5B能量代谢的影响。（2）通过Western blot方法检测胆固醇刺激对PC-3M细胞细胞膜上以及胞浆内ATP5B含量的影响。（3）通过Western blot方法检测短肽B04对线粒体ATP5B异位能力的抑制。（4）通过使用transwell小室来检测B04脂质体对PC-3M细胞迁移、侵袭能力的影响。实验结果:1.验证合成短肽B04对PC-3M细胞ATP5B的影响细胞荧光化学法检测发现,在使用200ug/mL B04溶液封闭PC-3M细胞后,ATP5B荧光强度和阳性率与对照组相比有及其明显的降低;Western blot检测发现,使用200ug/mL B04溶液封闭后ATP5B的蛋白量与未封闭组相比显著降低。以上结果表明:人工合成的B04短肽单链具有与噬菌体表面表达B04相同的封闭功能。2.合成B04脂质体并验证其性能通过HPLC建立出B04短肽的检测方法,得出游离B04的峰面积和破乳B04的峰面积,带入标准曲线公式,计算出相应浓度再通过包封率公式得出采用逆向蒸发法所制备的B04脂质体的包封率为44.1%。3.B04脂质体对前列腺癌细胞PC-3M细胞膜ATP5B异位表达的影响我们通过胆固醇负载6h,Western blot检测发现胆固醇负载组相比于无负载组,PC-3M细胞膜表面ATP5B蛋白明显地增加,细胞浆内则无论是否通过胆固醇刺激都无法检测ATP5B的表达。通过胆固醇负载6h,Western blot检测发现添加B04脂质体PC-3M组（25-100ug/mL,4h）相对于对照组细胞膜表面ATP5B有明显的下降,而总膜ATP5B则没有明显变化。4.B04脂质体对前列腺癌细胞PC-3M迁移、侵袭能力的影响Transwell小室迁移和侵袭实验中都表明,添加B04脂质体PC-3M组细胞数相对于对照组都有明显的下降,证明了肿瘤细胞的迁移能力与PC-3M细胞膜表面ATP5B异位表达量的多少具有正相关性。结论:1、人工合成的短肽B04对前列腺癌细胞PC-3M细胞膜表面ATP5B具有封闭作用。2、B04脂质体对前列腺癌细胞PC-3M细胞膜表面ATP5B的异位表达有抑制作用。3、B04脂质体对前列腺癌细胞PC-3M迁移、侵袭有抑制作用。