ADAR1在胶质瘤中的表达及其功能研究

来源 :第四军医大学 | 被引量 : 3次 | 上传用户:xiaotao_8730
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胶质瘤是人体常见的恶性肿瘤之一,其在中枢神经系统恶性肿瘤中拥有较高的死亡率。胶质瘤在颅脑疾病的死亡率中,位于脑卒中之后,居第二位。目前在恶性程度最高的胶质瘤中其中位生存期仅约为15.8个月,5年期生存率只约为9.6%。究其高死亡率的原因主要是因为胶质瘤细胞具有高度的异型性、较强的生物侵袭性及对化放疗等治疗不敏感的特点。而目前由于对胶质瘤发病机制尚未有完全的了解,所以尚未发现有效的治疗方案来治疗胶质瘤。因此深入的研究胶质瘤的发病机制已成为治疗胶质瘤急需解决的问题。而导致肿瘤产生的致癌作用是一个复杂的,多阶段的过程,它是细胞在受外源性和内源性的作用因子下共同发生发展所导致的结果。近年来,研究显示DNA突变为许多癌症的发生发展提供了重要的分子线索。特别是转录后的调控事件,例如RNA编辑,正在成为研究包括人类肿瘤等多种疾病的新方向。ADARs酶家族能够通过对转录后产生的目标RNA序列进行将腺嘌呤脱氨基的作用,使腺嘌呤转化为次黄嘌呤,影响翻译中碱基的配对,从而完成对RNA的编辑。这种编辑的表达和活化在对正常细胞的精细调控中是必不可少的。关于ADARs的RNA编辑在肿瘤领域的相关研究还主要集中在ADAR2上。目前研究认为,ADAR2与胶质母细胞瘤的增殖和侵袭性密切相关。ADAR2可以通过作用于离子型谷氨酸受体(AMPAR亚型)mRNA的Q/R位点,进而改变AMPAR对Ca2+的通透性,使细胞质内Ca2+浓度降低,从而抑制了肿瘤的增殖和侵袭性。同时相关研究在检测ADAR2在儿童胶质母细胞瘤上的表达时,发现ADAR1(p110)呈高表达。认为ADAR1(p110)可能和ADAR2形成异二聚体。从而影响ADAR2对AMPAR mRNA的编辑。但ADAR1与胶质瘤凋亡与增殖的相关研究未见报道。而本实验的研究目的在于检测胶质瘤中ADAR1的表达,以及探明在对人胶质瘤细胞系进行ADAR1干涉后,胶质瘤细胞系在增殖与凋亡等生物学行为上的改变,进而探明ADAR1在胶质瘤的发展机制中所发挥的作用。实验一检测ADAR1在不同类型成人胶质瘤中的表达目的对ADAR1在人胶质瘤组织上的表达给予蛋白定性的检测。方法通过Western-Blot和免疫组织化学等方法,检测人胶质瘤组织及其瘤旁正常组织中ADAR1的表达。结果ADAR1在胶质瘤中的表达明显高于其瘤周正常脑组织。结论本次试验的结果发现ADAR1在胶质瘤中的高表达,表明其与胶质瘤的发生发展,以及相关生物学功能存在一定的关联,为本实验后期检测干涉ADAR1后的胶质瘤细胞系的增殖力与凋亡率的变化提供了理论与研究基础。为进一步探明ADAR1在胶质瘤的发生发展以及对胶质瘤的治疗提供了新的理论基础与研究方向。实验二检测ADAR1在不同人胶质瘤细胞系中的表达目的通过对4种经典人胶质瘤细胞系中ADAR1表达的检测,选择出一种或几种ADAR1高表达的细胞系,作为后续研究ADAR1生物学功能的实验对象。方法采用Western-Blot方法对4种人胶质瘤细胞系中ADAR1的表达进行蛋白水平半定量检测。结果在对4种胶质瘤细胞系进行ADAR1表达的检测后发现,T98G胶质瘤细胞系中ADAR1的表达量最低,而U87,U251这两种胶质瘤细胞系中ADAR1的表达量较高,A172的表达量次之。结论发现本试验研究结果与相关研究结论一致,具有可靠性。因此后续试验将选择U87,U251这两种胶质瘤细胞系作为试验对象,以探明ADAR1与胶质瘤细胞凋亡和增殖的关系。实验三干涉ADAR1在人胶质瘤细胞系中表达目的通过ADAR1shRNA对U87,U251这两种胶质瘤细胞系进行转染,选择最佳转染效率的细胞系,并通过RT-PCR,Western-Blot等技术,分别对转染后的细胞系进行ADAR1的mRNA和蛋白量的检测。最后选择出干涉成功后的细胞系作为下一步检测细胞增殖力与凋亡的实验对象。方法运用ADAR1shRNA对U87,U251这两种胶质瘤细胞系进行顺转,待转染24h,48h,72h后通过荧光显微镜观察转染效率;然后根据荧光显微镜所观察到的转染效率,选取转染效率最高的细胞系作为试验对象;再通过RT-PCR,Western-Blot等技术,分别对转染后的细胞系进行mRNA和蛋白量的检测。结果通过倒置荧光显微镜分别于转染细胞24、48和72h后进行观察,发现转染48h时,ADAR1-shRNA的转染效率最高,转染72h后绿色荧光蛋白(EGFP)表达逐渐衰减,并发现大量细胞死亡;因此,选择在对细胞转染48h时进行ADAR1mRNA和蛋白表达进行检测。对ADAR1-shRNA转染48h的细胞进行RT-PCR和Wetern-Blot检测,结果显示ADAR1-shRNA干扰组ADAR1mRNA和蛋白的表达水平明显低于阴性对照组和空白组。结论结果发现转染48h时,ADAR1shRNA转染效率最高,因此后续试验将选择转染48h的胶质瘤细胞系作为试验对象,以明确ADAR1对胶质瘤细胞增殖与凋亡的影响。实验四检测人胶质瘤细胞系在ADAR1干涉后的增殖率目的通过MTT法检测上述两种被顺转的经典胶质瘤细胞系的细胞增殖能力。方法取用ADAR1shRNA进行转染胶质瘤细胞系,用MTT法检测这两种细胞系的增殖率。结果在用MTT法分别检测经质粒转染12h、24h、48h、和72h后的胶质瘤细胞系,结果发现ADAR1-shRNA干扰组与阴性对照组及空白对照组相比细胞增值率明显降低。结论通过本实验结果发现在进行了干涉ADAR1表达的胶质瘤细胞系中,实验组胶质瘤细胞的增殖率较对照组明显降低,因此认为在干涉ADAR1的表达后能降低胶质瘤细胞的增值率,而ADAR1的高表达与胶质瘤细胞的高增殖率有密切关系,高表达的ADAR1有促进胶质瘤细胞增殖的能力。实验五检测人胶质瘤细胞系在ADAR1干涉后的凋亡率目的通过流式细胞仪检测上述两种被顺转的经典胶质瘤细胞系的细胞凋亡水平。方法取用ADAR1shRNA进行转染48h的胶质瘤细胞系,用流式细胞仪法检测这两种细胞系的凋亡率。结果在用流式细胞术法检测经质粒转染48h后的胶质瘤细胞系,结果发现ADAR1-shRNA干扰组相比阴性对照组和空白对照组其细胞凋亡率明显升高。结论通过本实验结果发现在进行了ADAR1shRNA转染48h后的胶质瘤细胞系中,其胶质瘤细胞的凋亡率较对照组明显升高,因此认为在干预ADAR1的表达后能促进胶质瘤细胞的凋亡,而ADAR1的高表达与胶质瘤细胞的低凋亡率有密切关系,高表达的ADAR1有减少胶质瘤细胞凋亡率的作用。
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