机械性创伤主要是由于各种机械性致伤因素以机械力的作用引起人体组织或器官结构完整性的破坏或生理机能发生障碍。众所周知，严重的机械创伤可直接导致患者心脏（如心脏破裂和冠状动脉剥离）、大脑（脑出血、颅骨骨折）等重要器官衰竭，也可通过各种致伤因子造成人体多部位和多器官的继发性损伤。据报道全球每年约有600万人因机械创伤致死，而中青年人群占50% 以上，因此，对于机械创伤的防治具有非常重要的临床意义。　　有报道部分全身性机械创伤患者经入院观察24 h并未发现直接的心脏损伤，但却在出院的数日或数周并发心脏功能障碍、心律失常、心力衰竭、甚至心肌梗死等严重的心脏疾病，这种创伤所致的继发性心脏损伤（Trauma-induced secondary cardiac injury，TISCI）发病隐匿、极易漏诊，严重威胁病人的生命健康安全，受到越来越多国内外学者的关注，但迄今为止，其发生机制尚不清楚。　　心肌细胞凋亡是引起TISCI的重要原因。然而到目前为止，机械创伤是如何引起心肌细胞凋亡，进而导致继发性心脏损伤仍不明确。现普遍认为细胞凋亡是由一系列胱冬肽酶（Caspases）级联反应的结果，且主要有以下三条凋亡途径，分别是Caspase-8介导的死亡受体途径、Caspase-9介导的线粒体途径和Caspase-12介导的内质网应激途径，这三条途径最终通过Caspase-3活化，导致细胞凋亡。我们前期通过检测机械创伤后大鼠心肌组织Caspase-8 ， 9 ， 12 的活性发现，心肌组织Caspase-12 被最早激活，且早于心肌细胞凋亡显著增加的时间点。然而，在TISCI中是否通过激活内质网应激进而引起内质网应激途径凋亡尚不明确。　　内质网（Endoplasmic reticulum，ER）是真核细胞内重要的细胞器，在维持Ca2+稳态，脂质合成以及蛋白质折叠和转运方面发挥重要作用，破坏内质网稳态将会导致内质网应激（Endoplasmic reticulum stress，ERS）。一定程度的ERS可激活未折叠蛋白反应（Unfolded protein response，UPR）增加内质网内相关的蛋白质降解，恢复内质网正常的生理功能，可促进细胞的生存；相反，过度或持续的ERS将会启动ERS凋亡信号通路，诱导细胞凋亡。因此本研究通过建立在体和离体实验模型以及药理学药物干预等方法，旨在研究内质网应激在机械创伤致心肌细胞凋亡中的作用，进而为寻找临床预防和治疗TISCI的新靶点提供理论依据，同时也将为有效减少机械创伤致死率提供新的方向和思路。　　目的：　　从在体及离体水平观察内质网应激在机械创伤致心肌细胞凋亡中的作用。　　方法：　　1. 实验动物及分组：选取180-220 g的雄性SD大鼠，随机分为伪创伤组（Sham），创伤组（Trauma）和创伤+ERS抑制剂干预组（Trauma+4-PBA）。将创伤大鼠分为创伤后0 h，3 h，6 h，12 h，24 h 5组，每组8只。用Noble-Collip鼓制备TISCI大鼠模型。　　2. 实验细胞及分组：将H9c2心肌细胞随机分为正常血清培养组（Control），伪创伤血清培养组（Sham），创伤血清培养组（Trauma）和创伤血清+ERS抑制剂干预培养组（Trauma+4-PBA）。创伤血清培养组，是分别取创伤后3 h、6 h、12 h、24 h的大鼠腹主动脉血，提取血清后，用0.22μm MILLEX?GP的一次性针头式过滤器消毒创伤血清，加入DMEM培养基中，培养H9c2心肌细胞12 h，建立机械创伤血清所致心肌细胞损伤模型。　　3. 在体研究方法：采用免疫组化和Western blot检测ERS相关指标GRP78、PERK、p-PERK、IRE1α、p-IRE1α、ATF6，及ERS相关凋亡蛋白CHOP、Caspase-12、Caspase-3、Cleaved-Caspase-3 的蛋白表达情况；用 Caspase-3 活性试剂盒检测Caspase-3活性。　　4. 离体研究方法：用CCK-8试剂盒检测H9c2心肌细胞的存活率；采用Western blot检测ERS相关指标GRP78、PERK、p-PERK、IRE1α、p-IRE1α、ATF6，及ERS相关凋亡蛋白CHOP、Caspase-12、Caspase-3、Cleaved-Caspase-3的蛋白表达情况；用Hoechst 33258染色、流式细胞仪检测细胞凋亡水平。　　结果：　　1. 内质网应激是机械创伤致大鼠心肌细胞凋亡的重要原因　　1.1机械创伤促进大鼠心肌ERS相关蛋白GRP78、p-PERK、p-IRE1α 和ATF6表达升高　　免疫组化检测结果显示，GRP78、p-PERK、p-IRE1α 和ATF6的阳性染色颗粒均高于伪创伤组；Western blot检测结果显示，与伪创伤组相比，机械创伤后3 h 大鼠心肌组织GRP78表达开始增加， p-PERK、p-IRE1α 磷酸化水平明显升高，6 h均表达最高（P<0.01），而ATF6在机械创伤后6 h表达显著增加（P<0.05），12 h表达最高（P<0.01）。　　1.2机械创伤促进大鼠心肌ERS相关凋亡蛋白CHOP、Caspase-12和Caspase-3表达增加　　免疫组化检测结果显示，创伤组CHOP 、Caspase-12和Caspase-3的阳性染色颗粒均高于伪创伤组；Western blot检测结果显示，与伪创伤组相比，机械创伤后6 h 大鼠心肌组织CHOP和Caspase-3蛋白表达均开始增加（P<0.05）、Caspase-12的蛋白表达水平达到最高（P<0.01）。　　1.3 ERS抑制剂4-PBA降低机械创伤大鼠心肌CHOP和Caspase-12的表达　　选取创伤后6 h作为观察时间点，机械创伤后以100 mg/kg的剂量即刻给予大鼠腹腔注射抑制剂4-PBA，采用免疫组化和Western blot检测CHOP和Caspase-12表达情况，结果显示，创伤组CHOP和Caspase-12的阳性染色颗粒明显高于伪创伤组，心肌组织CHOP和Caspase-12蛋白表达较伪创伤组均显著升高（P<0.05）；抑制剂4-PBA干预后，与创伤组相比，CHOP和Caspase-12阳性染色颗粒减少；心肌组织CHOP和Caspase-12蛋白表达水平均下降（P<0.05）。　　1.4 ERS抑制剂4-PBA降低机械创伤大鼠心肌细胞凋亡水平　　创伤大鼠腹腔注射抑制剂4-PBA后，采用免疫组化和Western blot以及Caspase-3活性试剂盒检进行细胞凋亡水平检测，结果显示，创伤组Caspase-3的阳性染色颗粒较伪创伤组明显增加，其蛋白表达（P<0.05）和活性（P<0.05）均升高；抑制剂4-PBA干预后，与创伤组相比，Caspase-3的阳性染色明显减少，其蛋白表达和活性水平也明显回降（P<0.05）。　　2. 内质网应激是机械创伤血清致心肌细胞凋亡的重要原因　　2.1机械创伤后用创伤血清建立心肌细胞损伤模型　　用正常的胎牛血清、以及伪创伤和创伤后3 h、6 h的血清培养H9c2心肌细胞1 h、3 h、6 h、12 h、 24 h、48 h，用CCK-8法检测细胞存活率。结果显示，与伪创伤血清培养组相比，将创伤后3 h和6 h血清加入H9c2细胞，培养12 h下降均最明显（P<0.01），培养24 h及48 h细胞存活率均显著下降，但与培养12 h相比均无统计学差异（P>0.05）。以上结果提示，用创伤后3 h和6 h的血清培养H9c2心肌细胞1h、3h、6h、12h、24h及48h后，发现在培养时间点为12h 时，其细胞存活率最低。因此，本研究均采用培养H9c2心肌细胞12 h进行后续实验。　　2.2创伤后不同时间点的血清培养H9c2心肌细胞12 h，ERS相关蛋白GRP78、p-PERK、p-IRE1α 和ATF6 表达升高　　Western blot方法检测结果显示，与伪创伤血清培养组相比，用创伤后6 h血清培养的H9c2心肌细胞，GRP78蛋白表达以及p-PERK和p-IRE1α 磷酸化水平最高均达到最高（P<0.01）；用创伤后12 h血清培养的H9c2心肌细胞，ATF6蛋白表达水平最高（P<0.01）。　　2.3创伤后不同时间点的血清培养H9c2心肌细胞12 h，ERS相关凋亡蛋白CHOP、Caspase-12和Caspase-3表达增加　　Western blot方法检测结果显示，与伪创伤血清培养组相比，用创伤后12 h血清培养的H9c2心肌细胞，CHOP和Caspase-3蛋白表达均达到高峰（P<0.01）；用创伤后6 h血清培养的H9c2心肌细胞，Caspase-12蛋白表达最高（P<0.01）。　　2.4创伤血清培养H9c2心肌细胞给予抑制剂4-PBA预处理后降低CHOP 和Caspase-12的表达　　结合在体研究，给予4-PBA（5 mM）预处理后，用创伤后6 h的血清培养H9c2心肌细胞12 h，用Western blot方法进行检测。结果显示，与伪创伤血清培养组相比，创伤血清培养组中的心肌细胞CHOP和Caspase-12的蛋白表达水平均升高（P<0.05）；抑制剂4-PBA干预后，心肌细胞CHOP和Caspase-12的蛋白表达水平均降低（P<0.05）。　　2.5创伤血清培养的H9c2心肌细胞给予抑制剂4-PBA预处理后降低心肌细胞凋亡水平　　给予4-PBA进行离体干预后，采用Western blot方法、Hoechst 33258染色以及流式细胞术，观察细胞凋亡情况。结果显示，与伪创伤血清培养组相比，创伤血清培养组的心肌细胞凋亡水平明显升高（P<0.05）；抑制剂4-PBA干预后，心肌细胞的凋亡水平均明显降低（P<0.05）。　　结论：　　1. 机械创伤后可促进心肌ERS的发生，并激活ERS凋亡通路诱导心肌细胞凋亡。　　2. ERS在机械创伤所致心肌细胞凋亡的过程中发挥重要作用。