在体细胞中强制表达外源诱导因子将会促使体细胞重编程进而获得诱导多能性干细胞（Induced Pluripotent Stem Cells,iPS 细胞）。iPS 细胞不仅具有和胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells,ES细胞）类似的多能性,而且克服了 ES细胞的来源限制和伦理学争议等弊端,因此,被认为具有重大的应用前景。为推动iPS细胞走向临床应用,近年来,如何获得不含外源基因且高质量的iPS细胞成为科学家们研究的热点。然而,尽管众多研究小组先后利用不同的策略获得了不含外源基因的iPS细胞,但是,小鼠仍然是唯一能获得不含外源基因且具有生殖传递能力的iPS细胞的物种。其他物种所得iPS细胞是否具有和ES细胞相媲美的多能性还有待深入分析。大鼠是除小鼠外唯一具有生殖传递能力ES细胞系的物种,但是,与之相应的大鼠iPS细胞的获得目前主要还是依赖于病毒转染系统以及外源基因的整合。因此,如何利用大鼠ES细胞的优势探索并获得不含外源基因的大鼠iPS细胞具有重大研究意义。它不仅有助于揭示目前限制高质量iPS细胞获得的技术问题,而且能为其他物种的iPS细胞研究提供线索。本课题利用之前在小鼠上成功获得不含外源基因且具备生殖嵌合能力iPS细胞的非整合型的episome 诱导载体 pMaster3（包含 7 个人源重编程因子OCT4,KLF4,SOX2,C-MYC,NANOG,LIN28即 OKSMNL和NR5A2）,pMasterl2 人源 和新构建的诱导载体pMaster22（OKSMNL+NR5A2+大鼠来源miR-302/367）,分别对REFs进行重编程。结果显示,在常规诱导培养条件下（20%O2）,7因子载体pMaster3不能实现REFs的重编程。添加因子miR-302/367后,尽管可以实现大鼠iPS细胞的获得,但是重编程效率极低,而且获得的iPS细胞生长速度缓慢。采用低氧诱导培养条件（5%O2）,能够明显促进REFs细胞重编程得到iPS细胞。首先,在低氧条件下,7因子载体pMaster3亦可实现大鼠iPS细胞的获得,8因子载体pMaster12和pMaster22能将重编程效率提高约10倍,而且获得的iPS细胞生长旺盛,倍增时间短。随后,利用FIAU负筛选策略成功筛选得到了一系列候选克隆,通过严格的PCR分析,从中得到了真正的不含外源基因的大鼠iPS细胞系。这些不含外源基因的大鼠iPS细胞具有类似大鼠ES细胞的典型形态,克隆致密边界清晰且容易呈现漂浮状态。进行多能性分析发现,它们能在3i培养基中连续传代40次并且保持不分化状态。其他多能性指标,如碱性磷酸酶染色呈显著阳性;免疫荧光染色分析证实它们表达相关的多能基因;定量PCR分析显示这些iPS细胞具有和大鼠ES细胞类似的内源多能性基因表达水平。进一步分析iPS细胞的分化潜能发现,将iPS细胞皮下注射到裸鼠体内可分化形成畸胎瘤,在分化培养基中可分化形成拟胚体,二者都能分化形成来源于三胚层的细胞,证明该细胞具有显著的分化潜能:另外,将Leptin同源重组打靶载体导入iPS细胞,成功获得了进行精确基因修饰的基因打靶细胞。最后,将核型分析显示具有正确染色体数目的iPS细胞注射到囊胚中,得到了显著毛色嵌合的嵌合体大鼠,证明所得iPS细胞具有参与个体发育形成嵌合体的能力。以上的研究结果表明,本研究中所得的大鼠iPS细胞具有接近于大鼠ES细胞的多能性,尽管并没有获得能进行生殖传代的大鼠iPS细胞,这些研究结果对将来大鼠和其他物种获得高质量iPS细胞提供了重要的研究线索。