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目的非清髓异基因造血干细胞移植(NST)是近来发展迅速的移植治疗模式。由于预处理中细胞毒作用减低,移植后残留白血病的控制更依赖于供者淋巴细胞介导的GVL效应,因此,NST后GVL效应的监测对判断其预后、指导临床治疗等都具有重要意义。然而,虽然从1956年即认识到GVL效应的存在,但直到目前,其判定仍主要依靠临床疗效,关键在于缺乏客观的检测方法及评价指标,致使许多与GVL效应相关的临床问题无法得以深入研究。近来,Rezvani K等通过四聚体及胞内因子染色检测并分析了10例ALL患者移植后外周血WT1+CD8+CTL数量与WT1基因表达之间的关系,认为移植后外周血中WT1+CD8+CTL的数量可作为反映GVL效应的间接指标。既往研究表明,Tc1及Th1细胞是介导GVL的主要效应细胞,因此,上述研究虽然从CD8+T细胞角度对移植后的特异性免疫反应进行了探讨,但忽视了CD4+T细胞的作用。五聚体是在四聚体基础上发展起来的一种新的CTL检测方法,由于结合荧光素多,其荧光信号较四聚体增强,同时,其五个肽-MHC单体呈平面结构,与TCR的结合增强,而且其染色背景减弱,因此,五聚体较四聚体敏感性高。与胞内因子染色比较,五聚体检测侧重于定量分析,而胞内因子染色侧重于功能检测及亚群分析,因此,本实验拟采用五聚体联合胞内因子染色对白血病患者NST前后外周血中的WT1+CTL、WT1+CD8+IFNγ+及WT1+CD4+IFNγ+T细胞进行检测,分析其演变,并比较分析全合及半合移植患者、急慢性白血病患者间上述细胞生成的异同,以探讨WT1特异性免疫反应与GVL效应之间的关系。方法我们随访35例白血病患者及其供者配型结果;采用PCR等方法监测供受者移植前后WT1基因表达及移植后供受体嵌合水平。在移植前后不同时间点,采用HLA-A*0201/WT1五聚体及胞内因子染色(ICCS)方法检测白血病患者及其供者外周血中WT1+CTL、WT1+CD8+IFNγ+及WT1+CD4+IFNγ+T细胞;采用流式细胞仪对移植后不同时间点的淋巴细胞亚群进行检测,并计算CD4/CD8比例。根据上述检测结果比较分析:(1)供者外周血标本中WT1+CTL、WT1+CD8+IFNγ+及WT1+CD4+IFNγ+T细胞的检测情况;(2)五聚体及ICCS检测WT1特异性T细胞的异同;(3)患者NST前后WT1+CTL、WT1+CD8+IFNγ+及WT1+CD4+IFNγ+T细胞检测上的差异性;(4)上述细胞在NST后生成及峰值时相分布如何;(5)上述细胞NST后变化与WT1基因表达之间的关系;(7)全合移植与半合移植患者中WT1+CTL、WT1+CD8+IFNγ+及WT1+CD4+IFNγ+T细胞生成上的差异及其与淋巴细胞亚群变化之间的关系; (8)全合移植条件下AL与CML病人WT1+CTL、WT1+CD8+IFNγ+及WT1+CD4+IFNγ+T细胞生成上的异同及与淋巴细胞亚群变化之间的关系;结果主要实验结果如下:(1) WT1+CTL仅在WT1+A*0201+供受者中检出,WT1+A*0201-、WT1-A*0201+及WT1-A*0201-者均未检出WT1+CTL ; WT1刺激后, WT1+CD8+IFNγ+及WT1+CD4+IFNγ+T细胞仅在WT1+供受者中检出。(2)五聚体及ICCS检测时,WT1+CTL与WT1+CD8+IFNγ+T细胞在供受者中的检出率及移植后首次检出时间、峰值检出时间分布上均无明显差异(P>0.05),但后者首次检出时间在移植后+30天内的比例略高于WT1+CTL,而其峰值比例也明显高于前者(P<0.01)。(3)白血病病人移植后WT1+CTL、WT1+CD8+IFNγ+及WT1+CD4+IFNγ+T细胞的检出率均显著高于供者及移植前(P值均<0.01)。(4)移植后,WT1+CTL、WT1+CD8+IFNγ+及WT1+CD4+IFNγ+T细胞均在+30天左右及+90天后存在检出高峰。(5)NST后,WT1+CTL、WT1+CD8+IFNγ+及WT1+CD4+IFNγ+T细胞的变化趋势与WT1基因表达变化趋势基本相反。(6)全合移植患者其WT1+CTL、WT1+CD8+IFNγ+及WT1+CD4+IFNγ+T细胞的首次检出及峰值检出时间在+30天内的比例略高于半合移植患者,但移植后早期,上述细胞在全合及半合移植患者中的检出率无统计学差异(P值均>0.05)。(7)全合移植与半合移植患者WT1+CTL、WT1+CD8+IFNγ+及WT1+CD4+IFNγ+T细胞的峰值水平无明显差异(P值均>0.05)。移植后180天内,两类患者在T细胞亚群及CD4/8比例上无统计学差异(P值均>0.05)。(8) AL与CML病人WT1+CTL、WT1+CD8+IFNγ+及WT1+CD4+IFNγ+T细胞在移植前后的检出率均无明显区别(P值均>0.05)(P值均>0.05)。(9) CML病人其WT1+CTL、WT1+CD8+IFNγ+及WT1+CD4+IFNγ+T细胞的峰值水平略高于AL病人,但无统计学差异(P值均>0.05)。两类患者在GDMI后WT1特异性T细胞比例增高率及增高幅度亦无明显差异(P值均>0.05)。(10)移植后早期,AL及CML病人在T细胞亚群及CD4/8比例上无统计学差异(P值均>0.05)。结论(1)、移植能促进WT1+CTL、WT1+CD8+IFNγ+及WT1+CD4+IFNγ+T细胞的形成,而且这类细胞主要在移植+30天内生成。(2)、移植后早期生成的WT1+CTL、WT1+CD8+IFNγ+及WT1+CD4+IFNγ+T细胞可以间接反映GVL效应。(3)、全合与半合移植患者在移植后早期WT1特异性GVL效应生成上不存在明显差别,可能与全合与半合移植中免疫抑制剂应用差异等临床因素有关。(4)、急慢性白血病患者在WT1特异性GVL效应生成上不存在明显差异,推测两类患者移植及GDMI疗效的差异可能与不同类型白血病对相似GVL效应存在敏感性差异有关,而与GVL效应的生成无关。这一研究主要为通过检测白血病抗原相关抗原特异性T细胞以间接反映移植后由T细胞介导的GVL效应提供了一种相关检测方法,进而为通过评价移植后GVL效应对移植预后进行判断、并有根据地适当调整某些治疗提供了重要的参考依据。