利福平是一种一线抗结核药物,其引起的肝细胞毒性是一个重要的临床问题。目前对于利福平引起肝细胞损伤的具体机制还知之甚少。本文在体外条件下观察了利福平引起L02细胞、HepG2细胞损伤及其演变过程,从内质网应激角度观察了利福平对内质网应激相关蛋白和胆汁酸转运体相关蛋白表达、蛋白定位及基因表达的影响,运用分子生物学技术观察了CHOP基因、Nrf2基因沉默及过表达对利福平诱导细胞损伤的影响,以及采用药物4-苯基丁酸(4-PBA)干预的方法,初步探讨了利福平致肝细胞损伤的分子机制。1.利福平诱导L02细胞毒性损害研究为研究利福平诱导L02细胞损伤的剂量-效应和时间-效应关系,不同剂量的利福平(100μM,200μM,300μM,400μM)给药不同时间(12 h,24 h,36 h,48 h)后,倒置显微镜下观察L02细胞形态学改变,流式细胞术检测细胞凋亡率变化,MTT法检测细胞存活率变化,ELISA及微板法检测细胞培养上清中ALT、AST、AKP、LDH和ATP水平等方法,观察利福平的细胞毒性。结果发现正常L02细胞呈单层贴壁生长,形态与类上皮样细胞相似。给予利福平后,细胞形态发生改变,并且随着利福平剂量增加及给药时间的延长,细胞形态改变愈加明显,细胞变成长梭形甚至形态不均,贴壁细胞数量减少,漂浮细胞增多,可有细胞碎片出现。流式细胞仪检测细胞凋亡率发现随着利福平作用浓度增加及作用时间的延长,细胞凋亡率逐渐升高,200μM、300μM、400μM利福平给药12 h即可引起细胞凋亡率增加,400μM利福平给药48 h几乎导致所有细胞发生凋亡。MTT结果显示细胞存活率呈逐渐下降,与细胞凋亡率趋势相反。当利福平剂量超过100μM细胞存活率明显抑制,当作用时间超过24 h,四个剂量对细胞活力都有明显的影响。利福平24 h的IC50值是548.91μM,48 h IC50大约是234.96μM。同时,200μM利福平给药48 h细胞培养上清中ALT、AST、AKP、LDH和ATP水平均明显升高。2.利福平激活L02细胞PERK-ATF4-CHOP通路的研究为探讨利福平诱导内质网凋亡反应,100μM、200μM利福平给药48 h,观察其对GRP78、PERK、ATF4、CHOP蛋白表达及基因表达的影响。200μM增加了GRP78、PERK和ATF4的蛋白表达,而对CHOP蛋白表达未见明显影响。在基因水平,200μM利福平增加了GRP78、PERK、ATF4及CHOP的基因表达水平。100μM利福平没有明显的刺激作用。这表明利福平可以在蛋白和基因水平上激活PERK-ATF4-CHOP通路,并且具有剂量依赖性。接下来我们观察了200μM利福平治疗12 h、24 h及48 h对PERK-ATF4-CHOP通路的影响。结果显示12 h、24 h蛋白水平无变化,48 h时GRP78、PERK和ATF4的蛋白表达增加。在基因水平,利福平治疗12 h ATF4及CHOP表达增加,24 h时GRP78、ATF4及CHOP表达增加,而48h时整个通路被激活。这表明利福平激活PERK-ATF4-CHOP通路具有时间依赖性。3.CHOP基因在利福平诱导L02细胞凋亡中的作用我们通过转染CHOP-siRNA来观察CHOP基因沉默后对利福平诱导的细胞凋亡的影响。基因沉默效率通过qRT-PCR和western blot检测。与转染阴性对照siRNA组相比,CHOP基因表达减少了约70%,CHOP蛋白表达水平没有明显变化。有趣的是,CHOP基因沉默后再给予利福平治疗,在蛋白水平,GRP78、PERK、ATF4的表达均减少;在基因水平,CHOP、GRP78、PERK以及ATF4的表达均减少。同时发现细胞的凋亡率下降,细胞的存活率升高,细胞培养上清中LDH水平也下降。我们通过转染CHOP过表达质粒来观察CHOP基因过表达后对利福平诱导的细胞凋亡的影响。同样,基因表达效率通过qRT-PCR和western blot检测。与转染阴性对照质粒组相比,CHOP基因表达的水平增加了243倍,CHOP蛋白表达增加了17倍,CHOP基因过表达后再给予利福平治疗,在蛋白水平,GRP78、PERK、ATF4的表达未发生显著改变;在基因水平,GRP78的表达明显增加。同时发现细胞的凋亡率增加,细胞的存活率降低,以及上清中LDH水平上升。4.4-PBA抑制利福平诱导的L02细胞PERK-ATF4-CHOP通路的激活经4-PBA治疗后,利福平诱导的GRP78、PERK及ATF4蛋白表达降低,CHOP、JNK、p-JNK蛋白表达无明显改变。GRP78、PERK、ATF4及CHOP的基因表达水平均显著降低。免疫荧光分析表明GRP78、PERK及ATF4的荧光强度降低,CHOP荧光强度无明显改变。表明4-PBA可以在蛋白水平和基因水平抑制利福平诱导的PERK-ATF4-CHOP通路的激活。5.4-PBA对L02细胞的保护作用利福平能导致明显的细胞凋亡,经4-PBA治疗后细胞的凋亡率出现下降。MTT结果显示经4-PBA治疗后,4-PBA+利福平组细胞存活率较利福平组升高。4-PBA治疗后,ALT、AST、AKP、LDH及ATP水平均下降。6.利福平诱导HepG2细胞毒性损害研究为研究利福平诱导HepG2细胞损伤的效应,不同剂量的利福平(100μM,200μM,300μM,400μM)给药不同时间(24 h,48 h)后,倒置显微镜下观察HepG2细胞形态学改变,MTT法检测细胞存活率变化,ELISA及微板法检测细胞培养上清中LDH、ALT、AST、AKP、γ-GT、TBIL、DBIL、IBIL、TBA及ATP水平等方法,观察利福平的细胞毒性。倒置显微镜下,正常的HepG2细胞形态似上皮细胞样,细胞间相互连接,密集成片生长,胞浆内未见透明颗粒。给予利福平后,随着利福平作用浓度增加及作用时间的延长,细胞也变成长梭形甚至形态不均,贴壁细胞数量减少,细胞散在生长,漂浮细胞明显增多,折光加强。MTT检测发现随着利福平作用浓度增加及作用时间的延长,细胞存活率逐渐下降,同时细胞培养上清中LDH、ALT、AST、AKP、γ-GT、TBIL、DBIL、IBIL、TBA及ATP的水平逐渐升高,呈现出一定的剂量效应和时间效应。利福平24 h的IC50值是550.50μM,48 h IC50大约是311.01μM。7.利福平激活HepG2细胞胆汁酸转运体及Nrf2表达的研究为探讨利福平诱导胆汁酸转运体和内质网应激适应性反应因子Nrf2的表达,不同剂量的利福平给药不同时间后,观察其对胆汁酸转运体和Nrf2蛋白表达及基因表达的影响。在24 h,BSEP、MDR1、总Nrf2及胞核Nrf2的蛋白表达有不同程度增加。NTCP和胞浆Nrf2蛋白表达有不同程度减少。BSEP、MRP2、NTCP、OATP2、OSTβ、总Nrf2的基因表达有不同程度增加。在48 h,BSEP、MDR1、MRP2、NTCP、OATP2、OSTβ及总Nrf2的蛋白表达和基因表达均有不同程度增加。胞浆Nrf2蛋白表达有不同程度减少,胞核Nrf2的蛋白表达有不同程度增加。8.Nrf2基因在利福平诱导HepG2细胞胆汁酸转运体表达中的作用我们通过转染Nrf2-siRNA及Nrf2过表达质粒来观察Nrf2基因对利福平诱导HepG2细胞胆汁酸转运体表达的影响。基因沉默效率通过qRT-PCR和western blot检测。与转染阴性对照siRNA组相比,Nrf2基因表达减少了90%,总Nrf2蛋白、胞浆Nrf2蛋白表达减少了50%,胞核Nrf2蛋白表达减少了70%。Nrf2基因沉默后再给予300μM利福平治疗48 h,BSEP、MDR1、MRP2、NTCP、OATP2、OSTβ的蛋白及基因表达都有不同程度减少。细胞的存活率下降,细胞培养上清LDH水平上升。转染了过表达质粒后,与转染对照质粒相比,Nrf2基因表达增加了50倍,总Nrf2蛋白、胞浆Nrf2蛋白表达增加了2倍,胞核Nrf2蛋白表达增加了5倍。Nrf2基因过表达后再给予利福平治疗,胆汁酸转运体的表达均增加。同时细胞的存活率上升,细胞培养上清LDH水平下降。根据以上研究结果,本文得出以下结论:(1)利福平能够激活PERK-ATF4-CHOP通路,这与其诱导的细胞损伤密切相关,并且CHOP是利福平诱导细胞凋亡的作用靶点之一;(2)内质网应激抑制剂4-PBA能够抑制利福平诱导的PERK-ATF4-CHOP通路蛋白表达和基因表达,抑制L02细胞凋亡,增加细胞存活率,降低细胞损伤标志物的水平,因此具有细胞保护作用;(3)Nrf2介导了利福平诱导的胆汁酸转运体适应性增加。Nrf2可能是内质网应激和胆汁酸转运的关键调节因子。