酶催化在有机合成中是一种有效且绿色的生物转化手段,但是由于酶稳定性差,不易分离(即难回收),这限制了其在合成中更进一步的发展。酶固定化技术正好在稳定性、可回收利用等方面具有优势,但是传统的固定化酶普遍有活性降低的缺点,这在一定程度上限制了它在工业上的应用。而如今出现了一种既简单又有效的固定化技术,即酶-无机物晶体复合纳米花的制备。酶晶体中的酶活性中心通过无机载体限制在特定的空间,具有细胞环境类似的限域效应。本文在制备无机物-酶晶体的基础上,利用酶晶体具有限域催化的优点,将其应用在有机合成中,并让无机金属盐同时作为载体和助催化剂成为可能。本论文采用酶-无机物共结晶方法,制备出木瓜蛋白酶-磷酸铜晶体复合纳米花,并用于混乱催化Knoevenagel缩合反应。酶晶体首先通过混合的硫酸铜水溶液和在磷酸盐缓冲液中的酶在室温下制备而成。得到的酶晶体通过SEM表征,且其活力通过N-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基酰胺盐酸盐作为底物的水解反应来检测。分析结果显示磷酸铜酶晶体的负载率为94.5%,在最适条件下该酶晶体的水解活性是游离酶的15倍,且有很好的热稳定性。选取了一系列的条件(反应温度,时间和溶剂)研究并考查其对缩合反应产物产率的影响。在最适条件下,当苯甲醛和乙酰丙酮作为底物时,酶晶体催化得到的产率是游离酶催化的1.25倍。同时结果发现酶晶体在循环催化72 h后仍保持初始活性的87.8%,同时与游离酶相比,其稳定性也大大提高。而当进一步进行底物拓展时,大部分结果表示酶晶体的催化活性比游离酶好。结果还发现当其余反应条件相同时,不饱和醛上的取代基为强吸电子基团时比强供电子基团具有更好的产率,同时推测铜离子可能有降低不饱和醛上电子云密度的作用,促进碳碳键的生成。鉴于铜离子重金属离子的毒性会对人体和环境造成危害,不适合用于药物合成中,故选用钙离子来代替铜离子制得酶-磷酸钙复合纳米花。本文选择了6种酶(包括木瓜蛋白酶,菠萝蛋白酶,胰蛋白酶,疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶-TLL,南极假丝酵母脂肪酶B-CALB,胰蛋白酶-PPL)来制备酶-无机物酶晶体复合纳米花。得到的酶晶体的负载率都在95%左右,且都比游离酶表现出更好的活性和热稳定性。使用过的酶晶体可通过加入磷酸来溶解纳米花,并通过加热使蛋白变性分离,从而回收纳米花中的磷酸钙、磷酸氢二钙和磷酸二氢钙。通过重量检测,发现磷酸钙的回收率都在95%以上。此外,用回收的磷酸盐制备的酶晶体活性几乎不变。酶被磷酸钙限定在特定的空间,形成限域空间,酶与底物在特定的空间内能够更有效地结合,促进反应速率。将其中TLL制备得到的磷酸钙酶晶体用于催化克林霉素棕榈酸酯的合成中。其水解活性在最适条件下是游离酶的8.2倍且有较好的热稳定性。本文利用骨头中含有的大量磷酸钙,将其作为无机成分制备得到TLL酶晶体,其被称为天然源TLL酶晶体,其酶活是游离酶的8.9倍。在以石油醚为溶剂的条件下,酶晶体能催化得到69.6%的产率,游离酶能得到79.1%的产率。虽然游离酶催化的产率比酶晶体好,但是酶晶体可以进行循环催化,且催化活性在循环10次后(12 h/次)仍旧保持在90%以上。在酶晶体催化合成维生素A棕榈酸酯中,在最适条件下,酶晶体催化能够得到90.39%的产率,而游离酶催化只能得到61.31%的产率,且酶晶体循环催化10次(12 h/次)后还有73.2%的相对产率。总之,在本文中通过酶-无机物共结晶的方法制备了酶-无机物复合纳米花,实现了酶蛋白的简易固定化。无机物晶体的包埋使得酶蛋白在催化中呈现出一定的限域效应,以致酶蛋白稳定性和活性得以大幅提高。同时,在酶-磷酸钙复合纳米花的进一步研究中,通过磷酸钙结晶、酸解和再结晶方法,可回收和重复使用纳米花中的无机组分磷酸钙,从而实现酶和无机载体的双循环,避免了固定化酶过程中金属离子污染、载体难回收问题。而将酶-磷酸钙晶体复合纳米花用于棕榈酸酯类药物合成中,以其高活性、高稳定性及多次循环利用可有效降低相应药物的制备成本,因此酶-无机物晶体复合纳米花固定化方法可进一步丰富和推动酶固定化和催化理论与应用研究的发展。