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目的研究miR-506靶向结合UHRF1经KISS1/PI3K/AKT信号轴抑制结直肠癌细胞的增殖,迁移和侵袭能力。方法1.免疫组织化学染色和实时荧光定量PCR检测UHRF1 mRNA和蛋白在结直肠癌中的表达水平;分析UHRF1蛋白和KISS1蛋白相关性。2.结直肠癌细胞株(HCT116、LoVo、HT29、SW480)筛选出UHRF1高表达细胞株(HCT116)和低表达细胞株(SW480)。构建UHRF1敲低慢病毒和过表达慢病毒,分别感染HCT116和SW480细胞株。实时荧光定量PCR和蛋白印迹实验验证构建的稳转株。3.实时荧光定量PCR检测UHRF1过表达株和敲低细胞株中KISS1mRNA的表达水平;BSP法检测各组细胞中KISS1基因的甲基化程度。蛋白印迹实验检测KISS1,PI3K,p-PI3K,AKT,p-AKT,NF-κB,MMP9蛋白;EdU实验检测各组细胞的增殖情况;划痕实验检测各组细胞的迁移能力;Transwell侵袭实验检测各组细胞的侵袭情况。4.KISS1过表达慢病毒转染UHRF1过表达组和PI3K过表达慢病毒转染UHRF1敲低组,继续检测各组细胞KISS1,PI3K,p-PI3K,AKT,p-AKT,NF-κB,MMP9蛋白以及各组细胞的增殖,迁移和侵袭能力。5.生物信息学预测可能与UHRF1靶向结合的miRNA。从四株结直肠癌细胞株中筛选出该miRNA高表达和低表达细胞株,在高表达细胞株中感染miRNA敲低慢病毒,低表达细胞株中感染miRNA过表达慢病毒;采用实时荧光定量PCR检测是否构建成功。6.蛋白印迹实验检测各组细胞中UHRF1,KISS1,PI3K/AKT信号轴相关蛋白的表达水平;EdU实验检测各组细胞的增殖情况;划痕实验检测各组细胞的迁移能力;Transwell侵袭实验检测各组细胞的侵袭情况。7.UHRF1过表达慢病毒转染miRNA过表达组和KISS1过表达慢病毒转染miRNA敲低组,继续检测各组细胞UHRF1,KISS1,I3K/AKT信号轴相关蛋白的表达水平以及各组细胞的增殖,迁移和侵袭能力。8.通过裸鼠皮下成瘤实验进一步体内验证该miRNA是否靶向结合UHRF1经KISS1/PI3K/AKT信号轴抑制结直肠癌的增殖和侵袭能力。结果1.UHRF1 mRNA和蛋白在结直肠癌中的表达水平显著高于癌旁正常组织(P<0.0001),免疫组化实验表明在结直肠癌组织中UHRF1和KISS1蛋白表达呈负相关(P=0.0003)2.实时荧光定量PCR实验和蛋白印迹实验结果显示与对照组相比,UHRF1过表达组mRNA和蛋白显著升高(P<0.0001);UHRF1敲低组mRNA和蛋白较对照组显著降低(P<0.0001)证实构建成功。3.实时荧光定量PCR实验证实与阴性对照组相比,过表达UHRF1组显著抑制KISS1 mRNA表达(P<0.0001);与阴性对照组相比,敲低UHRF1表达显著促进KISS1 mRNA的表达(P<0.0001)。BSP实验检测证实过表达UHRF1增加KISS1基因甲基化(P<0.0001);抑制UHRF1的表达,KISS1基因甲基化程度显著下降(P<0.0001)。蛋白印迹实验证实UHRF1通过抑制KISS1蛋白的表达激活PI3K/AKT信号通路;EdU实验、细胞迁移实验和Transwell侵袭实验证实UHRF1通过KISS1/PI3K/AKT信号轴促进结直肠癌细胞的增殖,迁移和侵袭。4.生物信息学分析miR-506可能与UHRF1有潜在的结合位点。荧光素酶报告基因实验证实miR-506靶向结合UHRF1。实时荧光定量PCR实验发现四株结直肠癌细胞中,miR-506在HCT116细胞中表达最低,在SW480细胞中表达最高(P<0.0001)。在HCT116细胞和SW480细胞中分别感染miR-506过表达和敲低慢病毒,实时荧光定量PCR结果证实miR-506过表达和miR-506敲低稳转株构建成功;蛋白印迹实验证实miR-506靶向UHRF1激活KISS1蛋白的表达阻遏PI3K/AKT信号通路。5.EdU实验,细胞迁移实验,Transwell侵袭实验证实miR-506靶向UHRF1经KISS1/PI3K/AKT信号轴抑制结直肠癌细胞的增殖,迁移和侵袭。6.裸鼠皮下成瘤实验进一步证实miR-506靶向UHRF1通过KISS1/PI3K/AKT信号轴抑制结直肠癌的增殖侵袭能力。结论MiR-506靶向结合UHRF1经KISS1/PI3K/AKT信号轴抑制结直肠癌细胞的增殖,迁移和侵袭。