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近年来,随着活体荧光标记蛋白的技术的不断成熟以及远场超分辨成像技术的不断发展,使得观测活体细胞内部的微小生理活动成为可能。
本文通过生物活体荧光标记技术、物理荧光显微成像技术以及图像处理技术的相互结合,实时观测与跟踪了AcNPV病毒颗粒对SF9细胞的进攻过程。在实验室已有的设备基础上,利用氩离子激光光源、倒置荧光显微镜、高灵敏CCD、PZT压电陶瓷台,并基于PVCAM的C语言程序以及基于MATLAB开发了图像处理程序,建立了一套可实现实时观测与跟踪病毒颗粒尺度量级的生物相互作用过程的系统,在测量尺度上超越了通常的光学衍射极限。
本文研究的对象,草地贪夜蛾(SF9),属于鳞翅目夜蛾科昆虫,为多食性,主要危害玉米、高粱、甘蔗,等农业造成很大损失。杆状病毒代表种苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV),广泛应用于杆状病毒分子生物学的各种实验研究工作,该病毒因其宿主范围仅限于鳞翅日及少数膜翅目和双翅目昆虫而被认为在农业害虫的生物控制方面具有重要应用价值。传统的病毒感染细胞的研究主要是宏观的角度进行研究,只关注实验的开始条件和结果,并很少从病毒进攻细胞的实时过程中着手研究;因此从单细胞动态实时角度研究该病毒-细胞的生物过程和作用机理具有重要的科研意义。本论文利用了超分辨成像技术对这一动态过程进行了超分辨实时跟踪。
本文的跟踪了58次AcNPAM病毒攻击SF9活细胞的过程,其中观测到攻击的成功有7例,病毒与细胞膜表面接触后脱离的有8次,视场中只是观测到有病毒颗粒路过的有43次。分析得到了病毒攻击细胞时的平均速度,运动的平均步长,在细胞表面停留的平均时间等运动学参数。并发现(1)病毒的运动速率在靠近细胞时会加快(2)病毒的运动速度是影响其进攻的因素之一,速度越快攻击成功率越高,过程越简短(3)病毒攻击细胞的模式是将自身的遗传物质注入细胞膜内,同时自身的囊膜也会附着在细胞膜的表面,并渐渐融入到细胞膜内成为新的一部分(4)一个细胞可被数个病毒攻击,并且细胞所在的空间位阻越小,越容易被攻击(5)病毒攻击成功后还可以在细胞膜表面移动。