呋喃西林代谢物氨基脲免疫学检测方法的研究

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目的:制备完全抗原CPSEM-BSA,制备免疫探针抗CPSEM单抗-胶体金(Anti-CPSEM-Au)复合物和抗CPSEM单抗-胶体金-单链硫醇化DNA(Anti-CPSEM-Au-ssSHDNA)复合物,建立氨基脲(SEM)的胶体金免疫层析检测法和新型的免疫吸附生物条码检测方法,从而构建一个氨基脲的检测体系。方法:利用对醛基苯甲酸(4-CBA)将氨基脲(SEM)衍生成4-[[[2-(氨羰基)肼叉]甲基]-苯甲酸(CPSEM),再用活性酯法将CPSEM与牛血清白蛋白(BSA)交联制备完全抗原CPSEM-BSA用柠檬酸三钠还原法制备胶体金;用硫酸铵沉淀法纯化的抗CPSEM单抗标记胶体金,并对C/T线及金标抗体工作浓度进行优化。对制备的胶体金免疫层析试纸条进行敏感性、特异性和稳定性测定。在猪肉样品中添加SEM,衍生提取后用建立的胶体金免疫层析法和ELISA检测。在胶体金纳米颗粒上偶联抗CPSEM单克隆抗体和硫醇化单链DNA,基于竞争反应原理,结合PCR技术将ELISA中的酶信号转化为可扩增的DNA信号,建立新型的免疫吸附生物条码检测方法。结果:1.成功制备了氨基脲的衍生物CPSEM和高偶联比的完全抗原CPSEM-BSA。2.成功制备了20 nm圆形且均一的胶体金。3.成功制备了抗CPSEM单抗-胶体金(Anti-CPSEM-Au)复合物,建立了检测氨基脲的胶体金免疫层析法,5分钟内即可用肉眼观察到结果;最低检测限达到720ppt(pgmL-1),基本达到商用要求;特异性高,除了跟原药呋喃西林有一定的交叉反应,与其它类似物均没有交叉反应;稳定性好,室温下保存7周不失效。SEM衍生后从样品中回收检测,回收率达到82.4%-97.6%,ICA的检测结果跟ELISA呈现了很好的相关性。4.成功制备抗CPSEM单抗-胶体金-单链硫醇化DNA复合物,初步建立可检测8 ppt氨基脲的免疫吸附生物条码检测法。结论:1.建立了灵敏、特异、准确、稳定、简便、低廉和安全的检测肌肉组织中氨基脲残留的胶体金免疫层析法。2.初步建立了灵敏度更高针对氨基脲的生物条码检测法。
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