背景与目的： 藻蓝蛋白(Phycocyanin，PC)存在于蓝藻、红藻、隐藻和少数甲藻中，是藻类特有的捕光色素蛋白。由于藻蓝蛋白具有对光能吸收传递的特殊性质，已被用来作为肿瘤激光治疗的光敏剂。藻蓝蛋白带有荧光，可制成荧光标记物，用于临床医学诊断和免疫化学及生物工程等研究领域中。近期的研究显示，藻蓝蛋白还具有一系列重要的生理活性，其中对肿瘤细胞的抑制作用受到关注，为了提高抗肿瘤活性，富硒藻蓝蛋白的研究也日益活跃。 硒是人体必需的微量元素，具有重要的生理功能和广泛的药理作用。研究发现，蛋白质能够控制红色元素硒原子的聚合，形成以蛋白为核心、硒为膜，或者以蛋白质为分散剂的硒纳米粒子。该粒子粒径20-60nm，呈红色，易溶于水，对热稳定，不会转化成灰色、黑色元素硒，并且对小鼠具有抗氧化、抗衰老、增强免疫力、抑制肿瘤等生物活性。 藻蓝蛋白虽然具有生物活性，但普遍认为不如螺旋藻多糖显著。为了提高其生物活性，目前的研究多集中于生物富集硒，即在培养螺旋藻的环境中加入含硒物质，使硒在螺旋藻体生长过程中被利用并富集于细胞内。此种方法所得到的藻体中各部分均含有硒元素，且较难准确控制藻蓝蛋白与硒的比例。本实验采用藻体外缀合的方法，将纯化后的藻蓝蛋白与一定比例的硒作用，从而得到硒-藻蓝蛋白缀合物，能够准确控制硒在缀合物中的含量，并得到单一的硒-藻蓝蛋白，纯度高，操作较为简便。 藻蓝蛋白和硒都具有抗肿瘤活性，而许多硒.蛋白质复合物也都表现出一定的抑瘤作用。我们有理由假设硒-藻蓝蛋白缀合物因协同作用而使其抗肿瘤活性更强、对机体免疫系统的破坏程度更低。本实验对硒.藻蓝蛋白缀合物、藻蓝蛋白的抗肿瘤活性进行探究和对比，期望得到既有较好的抗肿瘤活性，又能够增强机体免疫力、最大限度减少对机体损害的新型活性物质。 方法： 1.采用细胞破碎、盐溶、盐析等方法，从螺旋藻中提取藻蓝蛋白粗品，探索高提取率、大规模提取的实验条件。 2.设计双水相萃取法最佳方案，纯化PC。以紫外-可见吸收光谱、等电点聚焦电泳检测PC的纯度。 3.Se(IV)与PC进行缀合作用，并对所得缀合物Se-PC进行表征(主要为紫外-可见吸收光谱和红外吸收光谱)，并与单纯PC进行比较。 4.KM小鼠随机分组，检验PC、Se-PC对荷瘤小鼠的肿瘤抑制作用。 5.以CY_为阳性对照组，考察PC、Se-PC各剂量组小鼠的胸腺指数、脾脏指数变化，对小鼠免疫系统的影响。 结果： 1.ATPE法纯化PC最佳条件如下：PEG-4000(w/w)15％，KPi(w/w)16％(K2HPO4与KH2PO4质量比为35:65)，pH=6.28，PC粗提液(w/w)10％。PC粗品经此ATPE体系纯化3次纯度可达3.83，回收率23.99％。经超滤后纯度可达到4.04。 2.纯化后的藻蓝蛋白测定紫外可见吸收光谱，在278nm、360nm和620nm处有特征吸收峰，等电点聚焦电泳测得等电点为4.3。主要技术指标与本实验室前期研究结果基本一致，说明PC提取纯化技术成熟，结果稳定。 3.Se-PC与PC的紫外-可见吸收光谱相比较，620 nm处的特征吸收下降，下降幅度与作用时间、Se(IV)和PC的摩尔比正相关；278 nm和384 nm处的吸收则随Se(IV)和PC摩尔比的增加和作用时间的延长而增大。红外光谱图中，PC的酰胺I带为1653.2cm-1，为α螺旋，而Se-PC缀合物的酰胺I带为1647.0cm-1，属无规则卷曲。 4.PC50 mg/kg/d、75 mg/kg/d、100 mg/kg/d给药组，抑瘤率分别为25.0％、293％、41.2％；Se-PC50 mg/kg/d、75 mg/kg/d、100 mg/kg/d给药组，抑瘤率分别为33.6％、37.9％、40.8％。且PC、Se-PC各剂量组小鼠的胸腺指数、脾脏指数均有所增加。 结论： 1.与传统柱层析法相比，双水相萃取法纯化PC的优势明显。ATPE法操作简单，耗时短，每次处理样品量大，能够最大限度地保留。PC的活性，适合较大体积PC粗提液的纯化工作。 2.缀合物在278 nm处吸光值的增加说明，随着缀合作用的进行，PC的空间结构发生了改变，使原来位于分子结构内部的酪氨酸和色氨酸暴露于分子表面。 3.PC、Se-PC均具有一定的抗肿瘤活性，且抑瘤率均与给药量正相关，最佳抑瘤效果均出现在100 mg/kg给药组，PC组为41.2％，Se-PC组为40.8％。 4.PC、Se-PC对小鼠免疫器官胸腺、脾脏均有一定的保护促进作用。与CY相比，虽然PC、Se-PC中低剂量组肿瘤抑制率偏低，但却有效地保护了机体免疫器官，此外，高剂量组对肿瘤既有较为理想的抑制率，又不必付出严重伤害机体正常功能的代价。