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慢性乙型肝炎是乙肝病毒(HBV)在宿主中不断增殖而引起的长期的进展性疾病,部分病程可迁延转为重型肝炎、肝硬化甚至肝癌。目前的治疗药物存在应答率低、副作用大、易产生耐药抗性以及停药后反弹等不足。中医药在病毒性疾病的治疗中具有明显优势,也是获得先导化合物的重要来源。本论文基于前期研究,对具有抗病毒、保肝护肝作用的中药有效成分进行结构修饰,为寻找发现高效低毒的抗HBV药物提供依据。1.目的对具有抗病毒、保肝护肝的中药有效成分五环三萜化合物进行结构修饰,寻找具有抗HBV活性的先导化合物。2.方法2.1目标化合物的合成:以齐墩果酸(OA)、熊果酸(UA)、甘草次酸(GA)等五环三萜化合物为原料,采用Jones试剂氧化、Baeyer-Villiger氧化、碱水解等反应,制备裂-A-五环三萜衍生物,通过现代波谱技术手段对得到的各化合物进行结构鉴定。2.2对HepG2.2.15细胞的毒性:采用噻唑蓝(MTT)比色法,观察各化合物对细胞存活率的影响,并计算半数毒性浓度(CC50)。2.3对HBsAg、HBeAg分泌的抑制作用:采用酶联免疫法(ELISA),观察各化合物对HBV表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)分泌的影响,计算化合物对抗原的半数抑制浓度(IC50);采用流式细胞技术对活性较好的化合物进行验证。2.4对HBVDNA、HBVcccDNA复制的抑制作用:采用荧光定量PCR法(FQ-PCR)筛选出具有较强抑制HBVDNA复制作用的化合物,再以FQ-PCR法评价筛选出的各化合物对cccDNA复制的抑制作用。上述测得数据均采用SPSS 13.0软件对数据进行统计学分析,判断组间差异是否有统计学意义。3.结果3.1 合成了七个裂-A-五环三萜-3,4-内酯:OA-2-1BV、OA-2-2BV、OA-Br-1-1、OA-4、GA-2、UA-2和F-1;三个内酯的水解产物OA-3、GA-3和UA-3;其中化合物GA-3、OA-2-2BV、OA-Br-1和OA-Br-1-1为新化合物,各化合物的结构经1H-NMR、13C-NMR、DEPT、IR、MS等现代波谱技术得到确证。3.2除OA-Br-1(CC50=100.4μM)外,其余各化合物半数毒性浓度CC50值均大于 400μM。3.3合成的裂-A-五环三萜-3,4-内酯对HBsAg、HBeAg两个抗原分泌的抑制作用均比原料有不同程度的提高,而水解产物相对于内酯化合物活性有轻微下降。活性最好的化合物OA-2-2BV和OA-4对HBeAg分泌的抑制作用随浓度增加而增大,ELISA实验测得二者IC50值分别为0.14μM和0.86μM,阳性对照药OA为813.6μM;流失细胞实验测得在25μM时,二者对HBeAg分泌抑制率分别达到33.5%和34.0%。各化合物对HBeAg分泌的抑制效果要优于对HBsAg的抑制。此外,裂-A-齐墩果烷型化合物(OA与GA系列)活性优于熊果烷型(UA系列)。C12/C13碳碳双键对抗原分泌的抑制活性有较大的贡献。3.4 合成的裂-A-五环三萜-3,4-内酯 OA-2-1BV、OA-2-2BV、OA-Br-1-1、OA-4、GA-2、UA-2和F-1对HBV DNA复制的抑制效果要优于其起始原料(<10%),在 25μM 时,抑制率分别为 51.40%、83.32%、82.36%、46.00%、27.93%和11.49%;各内酯的水解产物UA-3、GA-3和OA-3活性比水解前有所上升,尤其是化合物GA-3,抑制率为91.56%,与阳性药物拉米夫定(92.83%)相当。化合物 OA-2-2BV、OA-4 和 GA-3 抑制 HBVcccDNA 复制的 IC50分别为 32.7μM、33.5μM和12.3μM,且呈现剂量依赖性,提示化合物GA-3是一个很有潜力的抗HBV先导化合物。在抑制HBV DNA复制方面,同样齐墩果烷型化合物(OA与GA系列)优于熊果烷型(UA系列)。C12/C13碳碳双键对HBV DNA复制的抑制活性有较大的贡献。4.结论裂-A-五环三萜衍生物能显著提高五环三萜化合物的抗HBV活性,相较于原料OA,化合物OA-2-2BV和OA-4对e抗原的分泌的抑制作用提高约1000倍;化合物GA-3对HBVDNA的抑制率为91.56%,与阳性对照药拉米夫定相当;化合物OA-2-2BV、OA-4和GA-3抑制HBV cccDNA复制的IC50分别为32.7μM、33.5μM和12.3 μM,且呈现剂量依赖性。化合物GA-3是一个很有潜力的抗HBV先导化合物。裂-A-齐墩果烷型环化合物(OA与GA系列)抗HBV的活性优于熊果烷型(UA系列);C12/C13碳碳双键对抗HBV活性可能有较大的贡献。