目的:类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种以关节滑膜增生、关节软骨侵蚀破坏为特征的全身性、炎性自身免疫性疾病,RA的病因及发病机制目前尚不完全清楚,迄今尚无根治疗法。多种炎性细胞及促炎因子参与了RA的发生发展,其中单核/巨噬细胞集分泌因子、解剖及功能各异性于一身,是其它类型细胞不能比拟的。正因为如此,巨噬细胞影响着免疫和炎症反应各个方面,同时在许多疾病的病原学及发病机制中,特别是在RA发病中,起着重要的作用。细胞环亲素A(Cyclophilin A,CypA)是存在于多种细胞内的细胞溶质蛋白,免疫抑制剂环孢素A(cyclosporin A,CsA)作用的主要靶分子,具有肽脯氨酰顺反式异构酶作用参与蛋白折叠、胞质内蛋白运输、免疫紊乱机制调节、促进炎症反应等多种功能。研究报道提示CypA在RA患者滑液中显著高于骨关节炎(osteoarthritis,OA)患者,且与滑膜中总的细胞数相关联。在RA关节滑膜层内,CypA主要由巨噬细胞及内皮细胞表达,诱导细胞表达促炎因子促进关节软骨的降解。这些研究结果使CypA与RA关键的发病机制研究之间更加紧密了,但是CypA促炎作用的受体、信号通路及CypA对RA中巨噬细胞的调节作用尚未见明确报道。CD147分子,又称为基质金属蛋白酶诱导因子(extracellular matrix metaloproteinase inducer,EMMPRIN ),属于免疫球蛋白超家族,细胞环亲素A(Cyclophilin A, CypA)的受体之一。CD147在胚胎发育、器官形成、骨重建、创伤修复等生理学及肿瘤的发生转移、关节炎、纤维化等病理生理学中都发挥着重要的调节作用。本科室以往的研究结果证实了RA的滑膜细胞、单核/巨噬细胞及中性粒细胞膜表面CD147表达显著高于正常人,并通过CD147分子间相互作用促进细胞表达MMP-2、-9的表达及活性,进一步加深对软骨基质的降解、破坏。但在RA中关于其它炎症因子通过CD147受体来参与RA发生发展的研究尚未见报道。多个文献报道提示CypA通过与作用的靶细胞膜分子CD147结合,在CD147转导的信号作用下促进一些疾病的发生与发展,如AIDS、SARS、胰腺癌等疾病。但这一相互作用在RA发病机制中的作用却未见报道。因此,本实验在RA关节滑膜中存在大量CypA和单核/巨噬细胞高表达CD147基础之上,拟观察CypA对单核/巨噬细胞MMP-2、-9的表达及细胞的黏附能力的影响,并通过RNAi、抗体及拮抗剂封闭CD147功能来证实这一作用是否需要CD147分子的参与。本课题研究将CypA通过CD147分子相互作用、CD147分子介导信号通路的研究思路用于CypA在RA发病机制中的研究,该结果对进一步认识CypA、CD147分子及两者相互作用复合物在类风湿性关节炎发病机制的作用有着重要的意义,并为今后RA发展积极有效的新治疗思路提供了良好的理论基础。方法:1. CypA对类风湿关节炎滑液单核/巨噬细胞MMP-2、-9表达的影响收集临床上RA活动期患者外周血及关节滑液,使用单核细胞阴性分选磁珠获得单核/巨噬细胞;重组人M-CSF刺激单核细胞分化为巨噬细胞;重组人CypA刺激单核/巨噬细胞,明胶酶谱及侵袭小室实验观察细胞MMP-2、-9的表达及细胞侵袭能力的变化。CsA、AP-9等因子阻断CypA与CD147相互结合的作用,分析CD147在CypA对激单核/巨噬细胞MMPs表达及侵袭能力生物学功能中的作用。2. RNAi作用CD147选择人单核细胞系THP-1作为体外细胞研究对象,PMA诱导THP-1分化为巨噬细胞。设计作用与CD147分子的siRNA干涉片段,封闭细胞表面CD147分子的表达,流式检测RNAi效果3. CypA对THP-1细胞MMP-2、-9表达活性及侵袭、运动能力的影响重组人CypA刺激THP-1细胞,收集细胞及细胞培养上清,实时RT-PCR、明胶酶谱实验检测MMP-2、-9 mRNA及蛋白分泌水平的变化,细胞侵袭实验分析细胞运动、侵袭能力的改变。CsA、AP-9等因子阻断CypA与CD147相互结合的作用,分析CD147在CypA对THP-1细胞MMPs表达及侵袭能力生物学功能中的作用。4. CypA、CsA及AP-9对THP-1细胞CD147表达的影响观察本课题相关的CypA、CsA及AP-9作用THP-1细胞后,细胞CD147在mRNA及蛋白水平的变化情况。5. CypA通过MAPK通路对细胞NF-κB活性的影响核转录因子NF-κB转入细胞核内增强THP-1细胞MMP-9的转录及表达水平。在CypA的刺激作用下,通过免疫荧光实验来检测细胞胞浆及核内p50蛋白量的变化。同时使用CsA、AP-9等因子阻断CypA与CD147相互作用,分析CD147是否参与了这一信号通路。CD147分子通过MAPK通路上调细胞的MMPs的表达。本实验通过使用ERK、JNK及P38的三个MAPK通路抑制剂来分别阻断MAPK通路的作用,观察是否可以阻断CypA对NF-κB激活的作用,并明确这一作用中参与调节的MAPK通路。6. CypA对THP-1细胞Ca2+运动、细胞黏附能力的影响激光共聚焦观察CypA对细胞内Ca2+运动的影响,细胞黏附实验观察CypA对细胞与细胞外基质黏附能力的影响;同时使用CsA、抗CD147抗体HAb18等阻断CypA与CD147相互结合的作用,分析CD147是否参与CypA对细胞Ca2+运动、细胞黏附能力的调节作用。结果:1. CypA对类风湿关节炎滑液单核/巨噬细胞MMP-2、-9表达的影响M-CSF成功诱导单核细胞分化为巨噬细胞。明胶酶谱结果显示正常人及RA外周血单核细胞分化为成熟的巨噬细胞后,MMP-9表达显著增强,MMP-2无显著变化;CypA显著增加RA滑液内单核细胞/巨噬细胞、正常人及RA外周血单核细胞分化的巨噬细胞MMP-9的表达,而对分化前的单核细胞则无显著上调作用。CypA对正常人及RA外周血分化前后单核细胞的MMP-2均无调节作用。CsA及AP-9显著抑制CypA对细胞MMP-9的上调作用。侵袭小室结果显示正常人及RA外周血单核细胞分化为成熟的巨噬细胞后,细胞的侵袭能力均显著增强;RA外周血分化前后单核细胞的侵袭能力均高于正常人外周血分化前后单核细胞。CypA显著增加正常人及RA外周血巨噬细胞侵袭能力,而对单核细胞则无显著作用。2. RNAi作用CD147qRT-PCR及流式结果显示siRNA片段可以显著抑制CD147的表达,阴性对照siRNA对CD147表达无影响,选择siRNA I作为进一步实验的干涉作用。3. CypA对THP-1细胞MMP-2、-9表达活性及侵袭、运动能力的影响CypA可以显著增加分化前及分化后THP-1细胞MMP-9 mRNA及蛋白表达水平;而对MMP-2无显著作用。CypA增强分化前及分化后THP-1细胞的侵袭能力。RNAi、CsA、AP-9显著抑制分化前及分化后THP-1细胞MMP-2、-9 mRNA及蛋白分泌水平和细胞侵袭能力;同时可以抑制CypA对MMP-9的上调及细胞侵袭能力增强的作用。4. CypA、CsA及AP-9对细胞CD147的影响qRT-PCR及流式结果显示CypA对THP-1细胞CD147的mRNA及蛋白表达水平均无显著影响;CsA则显著抑制下调CD147的表达;AP-9可有效的封闭细胞膜表面CD147分子。5. CypA通过MAPK通路对细胞NF-κB活性的影响免疫荧光结果显示CypA显著增强THP-1细胞胞质内及核内p50蛋白量,CsA、AP-9则显著抑制CypA对p50的上调作用。明胶酶谱实验结果显示ERK及JNK MAPK抑制剂显著抑制THP-1细胞MMP-9的表达,同时可阻断CypA对MMP-9的上调作用;P38 MAPK抑制剂对THP-1细胞MMP-9的表达则无影响,且对CypA上调MMP-9的作用无抑制作用。6. CypA对细胞Ca2+运动、细胞黏附能力的影响激光共聚焦结果显示CypA显著增强THP-1细胞内游离Ca2+的运动,CsA及HAb18可阻断CypA对游离Ca2+运动的上调作用;HAb18显著抑制THP-1细胞内游离Ca2+的运动。细胞黏附实验结果显示CypA显著增强THP-1细胞与ECM的黏附能力,而这一作用可被CsA及HAb18阻断。CsA及HAb18显著降低THP-1细胞与ECM的黏附能力。结论:本课题研究结果显示CypA通过与CD47分子直接结合、上调单核/巨噬细胞MMP-9的表达及细胞侵袭运动能力,同时增强细胞内Ca2+运动及细胞与细胞外基质的黏附能力。这些研究结果提示在RA关节滑膜中,大量存在的CypA通过与单核/巨噬细胞膜表面CD147分子直接结合,增强了细胞与滑膜及软骨基质的黏附能力,并促进细胞分泌大量的MMP-9,进一步促进对软骨基质的降解及破坏,促进RA的发生及发展。这些研究结果为今后选择更加有效的治疗方法提供了良好的实验基础。