细胞凋亡又称程序性细胞死亡,在各种心血管疾病的发病机制中起到重要的作用。许多研究表明,心肌梗死,心肌病和心肌肥厚的心肌组织中都有细胞凋亡的发生。因为心肌细胞的再生能力有限,因此心肌凋亡引起的细胞损失会导致心力衰竭。抑制心肌细胞凋亡可以防止心力衰竭的发生。　　 活性氧(ROS)可以通过诱导细胞凋亡导致心肌损害。过氧化氢(H2O2)是ROS的主要来源,它可以穿过细胞膜,扰乱细胞的天然抗氧化防御系统,并导致脂质过氧化和细胞DNA的损伤。　　 过氧化氢酶(CAT),谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)和超氧化物歧化酶(SOD)是酶性抗氧化物家族成员,它们在细胞内起到抗氧化作用;它们是细胞内的氧自由基清除剂;它们是细胞内的抗氧化防御系统的一部分。许多研究证实,抗氧化物酶的过表达可以防止活性氧引起的心肌损伤。　　 Akt是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,可被生长因子、氧化应激等因素通过PI3K依赖途径激活。当受到各种因素刺激时,膜受体酪氨酸激酶可以激活PI3K,PI3K则将PI(4,5)P2转化为PI(3,4,5)P3,从而激活Akt。活化的Akt可以调节细胞周期进程,并与细胞死亡、黏附、迁移、代谢和肿瘤发生有密切关系。在心脏中,活化的Akt具有抑制细胞凋亡和保护心肌细胞的作用。有证据表明,在用心肌缺血预处理保护心脏的缺血/再灌注损伤中,Akt发挥了重要作用。　　 Akt可以调节Bcl-2家族蛋白的表达水平,并通过磷酸化调节Bcl-2家族蛋白的活性,而Bcl-2家族蛋白可以直接参与调控细胞凋亡。Bcl-2家族的一些成员如Bcl-2和Bcl-xL起到抑制细胞凋亡作用,而Bad,Bax等则诱导细胞凋亡。Bcl-2家族蛋白可根据它们的相对含量和磷酸化状态而形成同源和/或异源二聚体。有实验表明,Akt可以上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,当Bcl-2过表达,Bcl-2可以结合促凋亡蛋白Bax,形成Bcl-2/Bax的异源二聚体,保护细胞防止细胞凋亡。而当Bax高表达,游离的Bax蛋白可以形成诱导死亡的同源二聚体,导致细胞凋亡。Bad是一种促凋亡Bcl-2家族蛋白,它可以取代Bax与Bcl-2形成异源二聚体,使游离出来的Bax得以形成同源二聚体,诱导细胞凋亡。当Bad被磷酸化时,磷酸化的Bad无法再与Bcl-2结合,遂从Bcl-2异源二聚体中解离,显示抗细胞凋亡的作用。研究显示,无论在体外和体内,磷酸化的Akt可以使促凋亡蛋白Bad的136位丝氨酸磷酸化并通过抑制细胞凋亡起到保护心脏的作用。　　 黄芪甲苷(ASI)作为一种天然的皂甙,被列在2005年版中国药典中,可以用来评估植物药黄芪的质量。ASI已被证明具有多种生物及药理活性,包括抗肿瘤,抗乙肝病毒,抗肝脏纤维化,防治糖尿病并发症等作用。最近的研究显示,ASI有明显的保护心脏作用。但是,目前仍没有关于ASI是否能够保护心肌细胞氧化应激损伤的研究。　　 目前尚不清楚ASI是否具有抑制活性氧诱导的心肌细胞凋亡的作用,本研究的目的是探讨ASI是否能抑制H2O2诱导H9c2细胞凋亡及其可能的机制。　　 材料与方法：　　 1、细胞培养:H9c2细胞(大鼠心肌细胞系),在DMEM培养基中进行培养。加入10％胎牛血清和抗生素在37℃,5％的二氧化碳培养箱中培养。　　 2、分组和干预:本研究共分7组,(1)对照组(C组);(2)H2O2组,细胞暴露于100μM的H2O224小时;(3)、(4)、(5)黄芪甲苷组,黄芪甲苷分别以三种不同的浓度(1,10,20μg/ml)预处理24小时,然后暴露在100μM的H2O224小时;(6)、(7)组分别将PI3K的特异性抑制剂wortmannin(50 nM)和LY294002(15μM)分别加入到20μg/ml的黄芪甲苷组培养基中。　　 3、采用MTT法检测黄芪甲苷及H2O2对H9c2细胞存活力的影响,在490 nm测定吸光度,无细胞的孔作为空白对照。　　 4、采用相应的试剂盒来分别检测LDH,MDA,T-AOC,T-SOD,Gpx,CAT的活性。　　 5、采用激光共聚焦法检测细胞内活性氧的浓度。　　 6、采用Annexin V-FITC/PI法及Hoechst33258染色法来检测细胞的凋亡。　　 7、采用免疫印迹法检测Akt,P-Akt(丝氨酸-473),Bad,P-Bad(丝氨酸-136),Bax,Bcl-2蛋白的表达。　　 8、采用半定量实时RT-PCR法检测Akt,Bad,Bax,Bcl-2 mRNA的表达。　　 9、所有计量资料均用平均值(mean)±标准差(S.D.)表示。用统计学软件SPSS11.5进行数据分析,P＜0.05表示有统计学意义。　　 结果：　　 1、不同浓度的ASI(1、10、20μg/ml)对H9c2细胞可促进细胞存活,呈剂量依赖关系。　　 2、不同浓度的H2O2(10、50、100、200、400μM)对H9c2作用24小时细胞存活率呈剂量依赖性降低。用100μM的H2O2作用不同时间(12、24、36、48、60小时)导致H9c2细胞存活率呈时间依赖性降低。　　 3、不同浓度ASI(1、10、20μg/ml)预处理可以减轻H2O2诱导的H9c2细胞损伤,随着ASI浓度的增加,相应的MTT法检测的OD值也随之增加。　　 4、在H2O2作用后心肌细胞受到损伤,LDH和MDA的浓度均较C组明显增高,抗氧化酶活性较C组明显降低,细胞总抗氧化性明显下降。ASI(1,10,20μg/ml)预处理培养细胞,在H2O2损伤过程中,均较H2O2组细胞损伤减小,LDH和MDA浓度明显减少,而抗氧化酶活性和细胞总抗氧化性较H2O2组明显增加。　　 5、经H2O2处理24小时后,细胞内荧光强度明显增强,不同的浓度ASI(1、10、20μg/ml)预处理24小时后,与H2O2组相比细胞内荧光强度明显下降并呈浓度依赖性。　　 6、在荧光显微镜下,对照组细胞的细胞核呈圆形或椭圆形,染色均匀并呈现蓝色淡染,H2O2组见细胞核大量致密浓染、颜色白亮的凋亡细胞。经不同浓度ASI处理后,致密浓染、颜色白亮的细胞核逐渐减少,并呈剂量相关性。　　 7、采用Annexin FITC/PI法检测心肌细胞凋亡率的结果显示:H2O2组心肌细胞凋亡率明显高于C组;与H2O2组比较,ASI(1、10、20μg/ml)组细胞凋亡率明显降低,且随着ASI剂量的增加,凋亡率逐渐下降。　　 8、Western blotting结果显示:H2O2作用24小时后,Akt在各组中都有表达,差异无统计学意义,p-Akt,p-Bad,Bcl-2蛋白表达量较C组明显减少,Bax蛋白表达量较C组明显增加,差异具有显著性。ASI(1、10、20μg/ml)呈剂量依赖性增加p-Akt,p-Bad,Bcl-2蛋白表达,降低Bax蛋白的表达,差异有显著性。Wortmannin和LY294002预处理可以拮抗ASI的部分保护作用。　　 9、Real-time RT-PCR结果显示:H2O2作用24小时后,Akt,Bad,Bcl-2 mRNA表达均较C组明显减少,Bax mRNA表达则较C组明显增加；ASI(1、10、20μg/ml)呈剂量依赖性增加Akt,Bad,Bcl-2 mRNA的表达,降低Bax mRNA的表达,与H2O2组比较差异有显著性。LY294002和wortmannin预处理可以拮抗ASI的部分保护作用。　　 结论：　　 1、ASI对H9c2细胞存活率的影响具有时间和剂量依赖性。　　 2、ASI通过降低MDA,增加抗氧化物酶活性,提高总抗氧化能力来减轻H2O2诱导的细胞损伤。　　 3、ASI可能通过清除细胞内过多的ROS来参与H2O2诱导细胞损伤的保护。　　 4、ASI可能部分通过PI3K/Akt-Bad这一信号转导通路来参与抗H2O2诱导的细胞凋亡。　　 5、ASI还可能通过直接调节凋亡相关基因Bcl-2、Bax的表达来抑制细胞凋亡。