近年来全球癌症的发生率和死亡率呈现持续快速增长趋势,且这种情况在发展中国家尤为严峻,已经严重威胁人类健康与生命。目前,临床上治疗癌症的标准手段主包括手术、放疗、化疗,在过去的十年中癌症免疫疗法已逐渐发展成为第四种癌症治疗策略。肿瘤基因疫苗作为肿瘤免疫疗法的方式之一,在医学免疫学领域被广泛研究,并且已有多种肿瘤基因疫苗在临床研究中取得了可喜的结果。肿瘤基因疫苗是由编码肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原的基因与真核表达载体或病毒载体共同组成,肿瘤抗原通过DNA或病毒载体导入人或动物体内后,表达抗原蛋白,诱导机体产生特异性体液免疫反应及细胞免疫反应,从而产生抗肿瘤的免疫保护力。肿瘤基因疫苗设计的关键因素主要包括:抗原靶点、疫苗载体、免疫佐剂及免疫策略的选择。自1982年DNA重组技术首次应用于痘苗病毒开始,痘病毒、鸡痘病毒金丝雀痘病毒等多种痘病毒被广泛应用于开发基因工程活载体疫苗和生物药物。涉及癌症、艾滋病、肝炎、疟疾和结核等多种疾病的预防和治疗领域。高度减毒的宿主限制性病毒株MVA(Modified Vaccinia Virus Ankara)具有外源基因容量大、稳定高表达外源基因、独特的安全性及良好的免疫原性等生物学特性,作为疫苗载体在多种传染病及肿瘤防治的临床前和临床研究中被广泛应用。本课题组在前期的工作中设计了以MUC1和Survivin为靶点,CpG、sPD1、IL2为分子佐剂的DNA疫苗CpDV-IL2-sPD1/MS及腺病毒载体基因疫苗Ad-MS,并且将两种形式的疫苗联合使用,采用DNA prime-Ad boost的免疫策略,成功的在荷瘤鼠模型上诱导出了较强免疫反应,产生了较好的抗肿瘤效果。在本组前期工作的基础上,本篇论文主要探究了以MVA为载体,融合表达可溶性sPD1以及肿瘤抗原MUC1和Survivin的肿瘤基因疫苗的抗肿瘤效果,同时也初步尝试了其与DNA疫苗CpDV-IL2-sPD1/MS联合使用的效果。首先,我们成功地构建了融合表达可溶性sPD1、MUC1及Survivin的重组穿梭表达载体pSC11M1-sPD1/MS,然后与痘病毒载体MVA重组。通过大量的筛选工作,获得了能够稳定高表达外源蛋白的重组痘病毒疫苗MVA-sPD1/MS。同时,为了寻找理想的疫苗评价体系,我们构建了 RFP标记的稳定表达人.MUC1和Survivin分子的鼠源性黑色素瘤细胞系(RFP-MS+B16）,然后开展了不同克隆RFP-MS+B16细胞的成瘤实验及成瘤剂量摸索实验,最终建立了黑色素瘤小鼠肿瘤模型。然后,我们考察了单独痘病毒载体疫苗MVA-sPD1-MS(以下简称rMVA)在黑色素瘤小鼠模型上的抑瘤效果。结果表明,阴性对照PBS组小鼠平均瘤重为7.88±0.81g、rMVA组小鼠平均瘤重为6.61±2.45g,rMVA组抑瘤率31.12%(P>0.05),rMVA并没有产生预期的显著的抑制肿瘤生长的效果。为了提高疫苗的免疫原性及抗肿瘤保护力,我们将rMVA疫苗与本组之前构建的DNA疫苗联合使用,采用DNA prime-rMVA boost策略进行了免疫原性实验及抑瘤率实验。免疫原性实验结果表明DNA初免-rMVA加强免疫方案提高了小鼠的体液免疫反应,但在细胞免疫方面,仅增强了 IFN-y的分泌水平,并没有提高特异性CTL杀伤效果。在抗肿瘤方面,尽管检测到了在荷瘤鼠体内能够诱导一定程度的细胞免疫反应,但抑瘤效果不明显。另外,为了进一步提高rMVA疫苗的抗肿瘤效果,对免疫策略进行了优化,包括延长rMVA免疫间隔和提高疫苗的免疫剂量,结果表明优化后的rMVA疫苗组的抑瘤效果得到了提高,且优于DNA prime-rMVA boost 免疫组,DNA prime-rMVA boost 免疫组和单独 rMVA疫苗组两组的IFN-γ的分泌水平及抗体水平均有增强。综上,病毒载体疫苗rMVA能够增强机体的免疫反应,在一定程度上具有抑制肿瘤的作用,但是这种能力有限。另外,将其与DNA疫苗联用,并采用DNAprime-rMVAboost策略虽然增强了小鼠的免疫应答,但是没有提高抗肿瘤保护力,具体的机制有待进一步的研究。