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病原性细菌和真菌是许多疾病的病原体,一直困扰人类健康,可导致各类炎症、感染等疾病。目前,对常见致病菌的治疗多以药物治疗为主,但长期使用会存在副作用及耐药性等问题。天然产物槐糖脂(Sophorolipids,SLs)因其出色的性能而被广泛关注,一般来讲,槐糖脂可大致分为两类,即酸型槐糖脂(Acidic Sophorolipid,ASL)和内酯型槐糖脂(Lactonic Sophorolipid,LSL)。其中,内酯型槐糖脂因其显著的抗菌抗病毒抗肿瘤等作用引起诸多学者的研究。但由于槐糖脂由微生物发酵而来,生产成本较高,因此诸多关于槐糖脂的研究还停留在实验室阶段。大气和室温等离子体(ARTP)是一种紧凑而强大的物理微生物诱变工具,可用于多种微生物的突变繁殖。通过改变离子体剂量或处理时间,可以获得在DNA和寡核苷酸中具有多种随机断裂的突变菌株。因此,本研究首先探索和考察了利用ARTP获得高产槐糖脂菌株的可能性和实际意义,随后提取混合产物中的内酯型槐糖脂,考察了内酯型槐糖脂对常见病原细菌:金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、乳杆菌(Lactobacillus)和常见病原性真菌:白色念珠菌(Candida albicans)、红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)、犬小孢子菌(Microsporum canis)、马拉色菌(Malassezia)的抑制效果,接着分别选取具有代表性的菌株,考察了内酯型槐糖脂对它们的抑菌机理。通过上述研究,探索槐糖脂投入工业生产并作为常见病原菌抑制剂的潜力,开拓其应用范围。本文的研究内容及结果如下:1.ARTP对槐糖脂产生菌:球拟假丝酵母(Starmerella bombicola CGMCC 1576)的诱变。利用该诱变方式,构建了由106个突变体组成的突变体库,筛选出高槐糖脂产量的稳定突变体。传代培养5代后,分别有8、7和4个突变体可以提高30%以上内酯型槐糖脂,酸型槐糖脂和总槐糖脂产量。其中,对A6-9和A2-8突变体进行了分批补料培养,A6-9产生的内酯型槐糖脂和A2-8产生的酸型槐糖脂分别比野生菌株高74.3%和52.8%;另外,A2-8的总槐糖脂产量比原始菌株高34.17%。此外,对来自野生和突变菌株的槐糖脂的表面活性和HLB进行测定,发现从不同菌株获得的槐糖脂具有不同的特性。2.内酯型槐糖脂对病原性细菌的抑制效果考察。结果显示:内酯型槐糖脂对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌存在抑制作用,但对大肠杆菌、乳杆菌没有抑制作用,说明内酯型槐糖脂对革兰氏阳性菌和阴性菌没有绝对的偏好性。其对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的最小抑制浓度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)和最小杀灭浓度(Minimum Bactericidal Concentration,MBC)分别为0.05g/L、0.20g/L;4.00g/L、6.00g/L。3.内酯型槐糖脂对病原性细菌的抑制机制考察。扫描电镜结果显示内酯型槐糖脂使得细菌细胞表面形成褶皱,凹陷,细胞壁破裂,细胞形态不完整;细胞膜渗透性分析、胞内ATP及胞外紫外吸收物质含量变化说明在内酯型槐糖脂处理下,细菌的细胞膜渗透性增强,内容物外泄,胞内大分子物质流失;从而得出结论:内酯型槐糖脂破坏了细菌的细胞膜和细胞壁,进而抑制菌体生长。另外发现,在MIC浓度处理下,金黄色葡萄球菌内容物的流失率明显高于铜绿假单胞菌,因此大胆推测LSL对革兰氏阳性菌的抑制作用强于革兰氏阴性菌。4.内酯型槐糖脂对病原性真菌的抑制效果考察。结果显示:内酯型槐糖脂对白色念珠菌、红色毛癣菌、犬小孢子菌存在抑制作用,但对马拉色菌没有抑制作用。其对白色念珠菌、红色毛癣菌、犬小孢子菌的最小抑制浓度和最小杀灭浓度(Minimum Fungicidal Concentration,MFC)分别为6.00g/L、18.00g/L;10.00g/L、17.00g/L;8.00g/L、18.00g/L。5.内酯型槐糖脂对病原性真菌的抑制机制考察。扫描电镜结果显示内酯型槐糖脂能使白色念珠菌细胞表面形成褶皱,塌缩,细胞壁被破坏,细胞不完整;细胞膜渗透性分析、胞内ATP及胞外紫外吸收物质含量变化说明内酯型槐糖脂使得白色念珠菌细胞膜渗透性增强,内容物流失到胞外;显微镜观察发现,在内酯型槐糖脂处理下,红色毛癣菌菌丝生长受到抑制,菌丝形态变化明显,菌丝内部内容物流失,细胞壁不连续或破损;电导率、麦角甾醇含量变化说明红色毛癣菌细胞膜的合成被干扰,膜功能异常,从而生长被抑制。从而得出结论:内酯型槐糖脂破坏了真菌的细胞膜和细胞壁,进而发挥抑菌作用。但同在MIC浓度下,LSL对酵母类真菌的破坏强于癣类真菌,酵母类真菌的内容物流出率更高。