【摘 要】
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心血管疾病是涉及心脏或血管发育异常疾病的统称,包括心肌病、冠心病、中风等,占世界人口死亡原因的40%以上,给人类生活质量带来了巨大负担。斑马鱼基因组与人类基因组高度同源、胚胎透明、发育过程中整个心脏组织结构和血细胞流动能够被清晰观察等优点,使其成为心血管疾病研究中的重要模式动物。CRISPR/Cas9技术因其简单高效性,已成为基因功能研究的必备工具。HEG1是一种心脏发育相关蛋白,在心血管系统发育
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心血管疾病是涉及心脏或血管发育异常疾病的统称,包括心肌病、冠心病、中风等,占世界人口死亡原因的40%以上,给人类生活质量带来了巨大负担。斑马鱼基因组与人类基因组高度同源、胚胎透明、发育过程中整个心脏组织结构和血细胞流动能够被清晰观察等优点,使其成为心血管疾病研究中的重要模式动物。CRISPR/Cas9技术因其简单高效性,已成为基因功能研究的必备工具。HEG1是一种心脏发育相关蛋白,在心血管系统发育过程中起到重要作用。本研究拟利用CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼heg1基因,以期得到一种可稳定遗传的心血管疾病模型,用于心血管疾病药物筛选和研究。本研究利用CRISPR/Cas9技术在斑马鱼heg1基因外显子中进行基因编辑,成功得到可稳定遗传的heg1基因突变体品系,该突变体1号外显子有25个碱基缺失,仅保留12个氨基酸。形态学观察显示该突变体表现出严重的心血管畸形,包括心房和心室增大、心率减慢、静脉窦与动脉球间距增大、心囊面积增大、静脉血栓和血流迟滞等表征。分子生物学分析检测到斑马鱼心脏与血管标志基因（myh7、cmlc2、vegfc、flt4、scl）表达量异常。上述表征与人类扩张型心肌病临床表型相似。本研究将发育至72 h的野生型斑马鱼（wt）与heg1突变体(heg1-/-)进行转录组测序。结果显示两组差异基因数量为4814个,其中2442个基因在heg1-/-中出现上调,2372个基因出现下调。GO分析发现突变体上调基因主要富集在心肌发育方面,包括肌肉器官发育、肌细胞的发育、肌原纤维的组装等生物学过程;突变体下调基因富集在心血管发育方面,包括血管形态发生、血管发育、心脏发育等生物学过程中。KEGG分析显示上调基因主要富集到细胞黏附分子、ECM-受体相互作用、粘着斑等信号通路;下调基因主要富集到心肌细胞肾上腺素能信号传导、心脏肌肉收缩、VEGF等信号通路。转录组学结果证实了HEG1基因在心血管与心肌发育过程中具有重要作用。为了探索heg1突变体在药物筛选方面的应用,本研究选取了十种具有治疗心肌病功效的中药处理heg1突变体,包括强心益气类的人参、附子,活血化瘀类的赤芍、益母草、川芎、三七、红花,利尿类的茯苓、葶苈子、桂枝;结果显示,中药处理后,heg1基因突变斑马鱼的心包水肿减轻,血细胞堆积情况均有不同程度地缓解,其中人参恢复率最高,效果最佳。接着选取三种化合物单体人参皂苷Rb1、羟基红花黄色素A、盐酸川芎嗪,进一步验证,结果显示,单体处理后,heg1突变体心血管畸形均有或多或少地缓解,其中人参皂苷Rb1恢复率最高,效果最佳。本研究认为heg1突变体可用于心血管疾病,特别是心肌病治疗药物的筛选。接下来进一步探究了人参与人参皂苷Rb1对heg1突变体的疗效及分子机制,结合Tg(heg1-/-;cmlc2:e GFP)心脏双转基因斑马鱼和Tg(heg1-/-;flk1:e GFP)血管双转基因斑马鱼观察药物处理后突变体心脏与血管形态学变化,结果显示,人参及人参皂苷Rb1均可不同程度的恢复heg1突变体心脏与血管的形态异常,药物处理后心率、SV-BA间距、心囊面积等指标均有恢复。结合RNA-seq结果,我们通过q RT-PCR检测了人参与人参皂苷Rb1对heg1突变体心肌收缩信号通路关键基因以及VEGF信号通路关键基因的挽救效果;并得出结论,人参及人参皂苷Rb1可能是通过心肌收缩信号通路或VEGF信号通路影响HEG1基因,从而改善heg1基因突变斑马鱼的心血管畸形状态。本研究通过CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了heg1缺失突变斑马鱼,表型研究明确HEG1在心血管与心肌发育过程中具有重要作用;RNA-seq探索了HEG1影响心血管发育的分子机制;同时选取十种中药、三种单体处理heg1突变体,并评价药物治疗效果;最终明确疗效最优的人参与人参皂苷Rb1可能是通过心肌收缩、VEGF信号通路实现对heg1突变体挽救功效的。本研究人类心血管疾病研究提供了新的斑马鱼疾病模型,为心血管疾病临床治疗药物筛选提供了有效的工具,也为HEG1在心血管领域的研究以及人参与人参皂苷Rb1在心肌病治疗方面提供了一定的理论依据。
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