流行性感冒是由流感病毒引起的一种具有高度传染性的急性呼吸道疾病。对人类健康和生命造成巨大危害,同时也给全球的经济带来巨大的损失,是人类至今尚不能控制的世界性传染病之一。流感病毒是由八条单股负链RNA组成,并具有包膜结构的一类RNA病毒。流感病毒按照核蛋白和抗原特性的不同,可以分为A(甲)、B(乙)、C(丙)三种类型。在流感病毒表面,有两种重要的膜蛋白:血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。NA具有糖苷外切酶活性,能够催化糖苷键的水解断裂,从而使子代病毒从宿主细胞表面分离。NA在流感病毒感染、复制以及脱壳中的重要作用,使之成为抗流感病毒最有效的靶蛋白。目前,已被美国FDA认证的神经氨酸酶抑制剂类药物主要有扎那米韦、帕拉米韦和达菲(奥司他韦)。然而,流感病毒NA的突变使得病毒对扎那米韦、帕拉米韦和达菲产生了抗药性。所以,迫切需要开发新型的抑制NA药物。在我国,中药防治流感已经有了几千年的历史,但是对于中药中具体哪些成分对流感病毒的NA有抑制活性和这些成分抗流感作用的机制还缺乏系统深入的研究。在本论文主要研究以下5部分内容:1.中药单体化合物文库中神经氨酸酶抑制剂(NAI)的筛选本实验主要采用NA活性荧光检测法,由于甲型流感病毒根据其NA结构的不同,可以分为group-1(N1、N4、N5、N8)和group-2(N2、N3、N6、N7、N9),所以我们从两类NA中各选取一种NA(N1和N2)作为筛选的NA。首先,我们从300余种中药单体化合物文库中筛选出对H1N1的NA(N1)有抑制活性的化合物,然后再从中筛选出对H3N2的NA(N2)以及乙型流感病毒NA有抑制活性的化合物。通过筛选,我们得到了对以上三种NA均有抑制活性的4种化合物;芦丁、金丝桃苷、盐酸药根碱和羟基红花黄色素。然后测定化合物对这三种NA抑制的IC50值。2.筛选出的中药单体化合物在MDCK细胞及小鼠体内的抗流感活性研究为了检测我们所筛选出的对流感病毒NA有抑制活性的中药单体化合物对感染H1N1和H3N2病毒MDCK细胞的保护作用,我们首先确定了感染病毒的稀释度,即MDCK细胞感染一半时病毒的浓度(TCID50)。随后,我们采用病毒和化合物体外共同孵育后共感染MDCK细胞,以及病毒预感染MDCK细胞后再与化合物共孵育两种方法,利用MTT法检测化合物对H1N1和H3N2病毒感染MDCK细胞病变效应(CPE)的保护作用。结果表明,上述四种化合物在两种处理方式下对感染H1N1和H3N2流感病毒的MDCK细胞均有保护作用。随后,我们选取了芦丁进行了小鼠体内抗流感活性的研究。我们采用FM1流感病毒感染小鼠的模型作为研究芦丁体内抗流感病毒活性研究的动物模型。实验小鼠随机分成6组,分别为对照组,病毒组,达菲组以及芦丁低、中、高剂量组(50,100,200 mg/kg)。结果表明,芦丁可以减少小鼠因感染流感病毒而引起的体重减轻。同时,芦丁也能降低患病小鼠的肺指数,减少小鼠的死亡率。以上结果均说明芦丁对感染流感病毒的小鼠有显著的治疗作用。3.中药单体化合物对N1和N2的抑制机制研究为了研究化合物与NA结合的方式,我们测定了化合物在不同浓度以及不同底物浓度条件下N1和N2的酶动力学曲线,并利用双倒数作图分析了化合物对N1、N2的抑制类型。结果表明,芦丁、金丝桃苷和羟基红花黄色素对N1的抑制类型为非竞争性抑制,盐酸药根碱对N1的抑制类型为混合型抑制;它们对N2的抑制类型与N1的类型是相同的。随后,为了确定化合物与N1和N2的结合位点,我们利用分子模拟技术,将四种中药化合物与N1、N2进行了分子对接模拟。首先,我们利用Discovery studio中的MODELER程序,对未知结构的NA进行了同源建模并获得了可信度高的模型的。随后,对建模产生的N1和N2的结构利用Autodock软件与化合物进行分子对接模拟。结果表明,芦丁、金丝桃苷和羟基红花黄色素与N1和N2的结合都发生在NA的非催化区域;而盐酸药根碱在N1和N2的催化和非催化区域都可以结合。以上结果与我们利用酶动力学曲线所测定的抑制类型结果相一致。在模拟结合位点的同时,我们还得到了化合物与N1和N2之间分子的亲和力,亲和力的大小与化合物对酶的抑制效果直接相关。结果表明,我们所得到的化合物与NA亲和力和测定的IC50值具有对应的关系。4.中药单体化合物对新型流感病毒H7N9的抑制活性及抑制机制在2013年,一种新型的禽流感病毒H7N9在中国被确认并分离出来,该病毒对人类的高致病性及传播速度之快引起了全球广泛关注。我们利用NA活性荧光检测法检测了四种化合物对H7N9的NA(N9)的抑制活性。结果表明,我们所筛选出的四种化合物对anhui型N9同样具有抑制活性。我们还利用双倒数作图法确定了芦丁、金丝桃苷和羟基红花黄色素对N9的抑制为非竞争性抑制,而盐酸药根碱对N9的抑制为竞争性抑制。随后,我们对上述四种化合物和N9进行了分子对接模拟。我们首先在PDB数据库中检索到anhui型N9的晶体结构,并利用Autodock软件对四种化合物和N9分别进行了分子对接模拟。结果表明,芦丁、金丝桃苷和羟基红花黄色素与N9的结合位于N9的非催化区域,盐酸药根碱与N9的结合位于催化区域。这与我们利用双倒数作图法测定的结果具有一致性。在分子模拟推导结合位点的同时,我们也测得四种化合物与anhui型N9的亲和力。我们发现亲和力与IC50的数值存在对应的关系。5.中药单体化合物与羧酸奥司他韦联合使用对流感病毒NA抑制活性的影响奥司他韦是目前为止治疗流感最有效的药物,但是随着其广泛的使用,抗药性流感病毒已经出现的越来越频繁。我们利用联合用药的方式,测定我们所筛选出的中药单体化合物与羧酸奥司他韦(奥司他韦的活化形式)对NA的抑制活性,并测定两种化合物之间的联合指数(CI),以此来确定化合物与羧酸奥司他韦联合作用的效果。我们采用先加入化合物后加入羧酸奥司他韦以及先加入羧酸奥司他韦后加入化合物两种处理方法,测定了其对NA的抑制活性。结果表明,芦丁、金丝桃苷和盐酸药根碱与羧酸奥司他韦对N1的抑制均有协同作用,羟基红花黄色素与羧酸奥司他韦对N1的抑制为拮抗作用;四种化合物与羧酸奥司他韦对N2和anhui型N9的抑制均表现出协同作用。但是对于N9的抗奥司他韦突变型shanghai型N9,只有金丝桃苷与羧酸奥司他韦能表现出协同作用。通过本研究,我们发现了4种能够抑制流感病毒NA的中药单体化合物:芦丁、金丝桃苷、盐酸药根碱和羟基红花黄色素。它们能够对于感染甲型流感病毒的MDCK细胞起到保护作用。并且这四种化合物与羧酸奥司他韦联合使用能够对不同的流感病毒NA起到协同抑制的效果。这为中药单体化合物在临床上对流感治疗提供了新的思路和方法,同时也为开发高效抑制流感病毒的药物提供了实验的依据。