研究背景与目的冠心病(coronary heart disease, CHD)作为一种全球性的疾病,随着经济发展,生活水平的提高,饮食结构与生活节奏的改变,运动量的减少,其发病率与日俱增。来自美国弗明翰的研究发现,年龄超过65岁的老年人中绝大多数心血管事件的发生均是由冠心病引起的。据世界卫生组织(WHO)推测,未来二十年心肌梗死将成为人类的第一死因。目前,糖尿病(diabetes mellitus, DM)是导致冠心病发病率和死亡率增加的主要因素,伴有DM的冠心病患者,其心肌梗死和血运重建治疗的预后均差于不伴有DM的冠心病患者,而且其冠状动脉的进展程度也快于不伴有DM的冠心病患者。因此,糖尿病在冠心病的发生、发展中的作用逐渐被人们所重视。2001年美国国家胆固醇教育计划(NCEP)成人治疗第三次报告(ATPⅢ)[2]中,将糖尿病提高到冠心病的等危症的高度。而糖尿病对冠状动脉的损害机制尚不明确,越来越多的证据表明高血糖与内皮功能和形态学异常间存在着紧密联系。高糖已经被揭示在培养的内皮细胞中可以干预细胞周期、增加DNA损伤、延迟内皮细胞修复并造成细胞过度死亡。Sirturin蛋白家族是NAD+依赖性去乙酰化酶,哺乳动物的sirturin家族在多种代谢通路(包括糖、脂、蛋白质等的生物合成)以及抗氧化应激中发挥至关重要的作用。sirturin家族因具有调控多种生理过程的功能,从而成为备受关注的治疗代谢和衰老相关疾病的潜在靶点。虽然sirturin家族在哺乳动物老化中的确切作用尚待深入阐明,但近期较为密集的研究已经揭示线粒体sirturin蛋白SIRT3可以调节热量限制,并且在监视老化进程的变化中扮演重要角色[9]。目前研究表明,SIRT3高表达是和人类长寿唯一有关的蛋白。PPAR-a(过氧化物酶体增殖物激活受体)属于II型核受体超家族成员,为配体激活的转录因子,在糖脂代谢中起关键作用[13],是线粒体生物合成的主要调节分子,它能调节多种能量代谢相关酶基因的表达,并且其在心血管领域的作用受到越来越多的关注[14]。越来越多的研究表明PPAR-α具有降脂及抗炎作用,并且起到延缓动脉粥样硬化的作用。因此,本文拟分为两部分：1、临床研究部分意在观察伴有DM的冠心病患者,其血糖控制情况对冠心病病情进展的影响,进一步了解糖尿病对冠状动脉粥样硬化进展情况的影响,加深我们对伴有DM的冠心病患者血糖控制的重要性的认识。2、基础实验部分意在探究高糖条件下,细胞质全长SIRT3与PPAR-a蛋白水平表达量的变化及细胞质全长SIRT3与PPAR-a蛋白在动脉内皮损伤中的作用,并且观察SIRT3与PPAR-a是否存在协同作用,为进一步从分子水平揭示动脉粥样硬化病理生理过程中内皮损伤的机理提供新的思路和研究基础。研究方法1、临床研究：首先,将纳入标准的60例患者将分为2组,其中对照组为血糖控制良好的CHD伴DM患者30例；暴露组为未行规律血糖控制或血糖控制不理想的CHD伴DM患者30例。两组患者在年龄、性别、BMI、CHD及DM平均病程、高血压病史、冠心病临床分型、冠脉造影结果、血糖及血脂控制情况(通过糖化血红蛋白(HbA1c)和LDL-C来评价)、收缩压(SBP)及舒张压(DBP)等方面均衡性良好。然后,观察3年后两组血糖及血脂控制情况,3年期间心绞痛等症状的发作情况,再住院率以及行冠脉造影后冠脉受损情况。比较这些指标有无统计学差异。2、基础研究：(1)培养HAEC,选择生长状态良好的细胞株。(2)将指数生长期的HAEC随机分为正常对照组、11mmol/L葡萄糖组、16.5mmol/L葡萄糖组、22mmol/L葡萄糖组、27.5mmol/L葡萄糖组、33mmol/L葡萄糖组、38.5mmol/L葡萄糖组。(3)将上述细胞分别给予梯度浓度葡萄糖处理24小时。(4)以蛋白免疫印迹法(Western blot, WB)检测各组细胞质全长SIRT3、PPAR-α、iNOS、eNOS蛋白水平的表达,并比较这些指标有无统计学差异。研究结果1、临床研究：(1)两组患者在年龄、性别、BMI、CHD及DM平均病程、高血压病史、冠心病临床分型、HbAlc、LDL-C、SBP、DBP、冠脉造影结果等方面均衡性良好(P>0.05)。(2)在3年间,两组患者的血压控制情况一直比较良好,可排除高血压因素对实验结果造成的影响(P>0.05)。(3)3年后,与对照组相比,暴露组患者BMI、HbAlc、LDL-C水平有明显升高(P<0.05)；并且与3年前相比,3年后暴露组患者BMI、HbAlc、LDL-C水平也有明显升高(P<0.05)。(4)3年后,对对照组相比,暴露组患者心绞痛发作次数并无明显差异(P>0.05),但是其再次住院率明显增加(P<0.05),冠脉受损情况明显加重(P<0.05)。2、基础研究：(1)加用梯度浓度葡萄糖刺激24小时后,随葡萄糖浓度提高,可见细胞生长速度减慢,细胞生长状态变差,细胞边缘毛糙,胞质内外代谢物增多。(2)在正常对照组人主动脉内皮细胞细胞质中可检测出全长SIRT3、PPAR-α、iNOS、eNOS蛋白。(3)受到梯度浓度葡萄糖刺激所引起的应激时人主动脉内皮细胞细胞质中均可检测出全长SIRT3、PPAR-α、iNOS、eNOS蛋白。(4)各组间β-actin蛋白表达量无明显差异。(5)各梯度浓度葡萄糖处理组与正常对照组相比,细胞质全长SIRT3、PPAR-α、iNOS、eNOS蛋白表达量均存在明显差异。各梯度浓度葡萄糖处理条件下各组细胞质全长SIRT3、PPAR-α、iNOS、eNOS蛋白表达量存在显著差异,且随葡萄糖浓度增高,细胞质全长SIRT3、PPAR-α、eNOS蛋白表达量有逐渐增高而后下降趋势,且在27.5mmo1/L时表达量最大；而iNOS蛋白表达量在11mmol/L时表达量最高,而后逐渐递减,在27.5mmol/L时表达水平较低。结论1、临床研究：糖尿病为冠心病的高危因素,现在指南中已经把糖尿病看做冠心病的等危症,可见对于伴有DM的冠心病患者,规律控制血糖至关重要。2、基础研究：(1)正常人主动脉内皮细胞细胞质中存在全长sirt3以及PPAR-a蛋白。(2)高糖短暂刺激后人主动脉内皮细胞细胞质中全长SIRT3以及PPAR-a蛋白表达量显著增高,且随葡萄糖浓度增高,细胞质全长SIRT3以及PPAR-a蛋白表达量呈现先增高后降低的趋势,并且在27.5mmol/L时表达量最高。由此可见SIRT3与PPAR-α蛋白可能参与抵抗高浓度葡萄糖对内皮细胞的损伤应激机制。(3)HAEC在受到不同浓度梯度葡萄糖刺激后,其PPAR-a蛋白、SIRT3蛋白与eNOS蛋白的表达呈线性正相关关系,与iNOS蛋白的表达呈线性负相关关系,由此可见在抵抗应激损伤的过程中,SIRT3蛋白与PPAR-α之间存在协同作用,PPAR-a可能在SIRT3参与抗应激损伤的机制中起到重要作用。(4)本实验构建人主动脉内皮细胞高糖模型,成功模拟了体内高糖对内皮细胞的直接损伤,提示全长SIRT3与PPAR-a参与内皮细胞损伤的相关保护机制,为全长SRIT3以及PPAR-a与氧化应激的相关研究奠定了实验基础。