胰腺癌是一种恶性程度极高的消化道肿瘤之一,占消化道恶性肿瘤的8%-10%。近年来在全球范围内发病率逐年增高,2011年全球约276000人因患胰腺癌而失去生命。虽然目前治疗方法已经改进,但大多数胰腺癌患者因早期缺乏典型的临床症状,加之其进展快、易早期远处侵犯和转移、缺乏高效肿瘤标志物和检测手段等特点,导致胰腺癌早期诊断很困难,许多病例临床确诊时,已失去唯一可能得到根治的手术机会。再者胰腺癌对放化疗均不敏感,预后很差,2年总体生存率不足20%。大量文献报道,许多微小RNA(microRNA,miRNA)参与了对胰腺癌发生机制的调控,起到抑癌基因或致癌基因的作用。微小RNA(miRNA)是一组非编码内源性单链小分子RNA蛋白,由Lee等首先在线虫的胚胎中发现。迄今为止,miRBase数据库已经收录了包括动物、植物在内的将近200个物种的两万多种miRNAs,并且预测miRNA可能调控约50%人类基因。miRNA主要通过结合靶基因特定序列,抑制靶蛋白合成,进而调控基因表达。故miRNA可作为恶性肿瘤靶向治疗点。最近研究表明超过100种miRNAs在胰腺癌中异常表达,在胰腺癌患者的循环、胰液、排泄物(粪便、尿和痰)、组织中等均可检测到异常表达的miRNA.在循环中,Li等检测发现miR-200a和miR-200a在胰腺癌患者血清中显著升高。在胰液中,Habbe等研究发现miR-155和miR-21在健康者的胰液中呈低表达,而在胰腺肿瘤患者中的表达明显上调。在粪便中,link等通过检测发现正常对照组和胰腺癌患者粪便标本发现miR-216a等4种miRNAs的表达水平在胰腺癌患者较低,正常对照组表达较高。在组织中,Zhang等发现8个miRNAs (miR-196a等)在大多数胰腺癌组织中表达上调。这些在胰腺癌中异常表达的miRNAs可作为肿瘤标志物。目前胰腺癌的标准化疗方案是以吉西他滨为基础,但在改善临床症状和延长生存率方面优势欠佳。越来越多的研究证明, miRNA可作为胰腺癌的靶向治疗点。Park等在细胞水平通过转染miR-21反义寡核苷酸证明下调miR-21表达可使胰腺癌细胞的成活力降低。Ali等也发现拮抗miR-21可以增强胰腺癌细胞对吉西他滨的化学敏感性。Mercatelli等采用抑制剂干预前列腺癌裸鼠移植瘤发现可通过RNAi调控miR221/222水平作为肿瘤治疗的靶点。这为胰腺癌靶向治疗提供了多种可能的靶点选择。研究表明miR-216a在胰腺癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌等恶性肿瘤中表达下调。我们的前期研究比较胰腺癌和正常胰腺组织中miRNA表达,发现70个miRNAs的表达存在统计学差异,其中与正常组织相比,miR-216a在胰腺癌患者中表达显著下调。因此,miR-216a可能是有潜力的的生物标记物。我们进一步预测了miR-216a的靶基因,并在细胞实验水平利用激动剂和抑制剂通过证明在胰腺癌中JAK2是miR-216a的靶基因,miR-216a通过下调靶基因JAK2表达,进而促进胰腺癌细胞的凋亡。所以可以对miR-216a进行基因沉默、反义寡核苷酸阻断或miRNA修饰,为胰腺癌提供新的治疗途径。虽然目前临床应用并不十分满意,但动物试验结果令人振奋,可以肯定的是,miR-216a在胰腺癌诊断标志物和治疗手段具有重要的潜在价值。目的：基于miR-216a目前的研究现状及其在胰腺癌发生发展中可能存在的作用,本研究旨在建立裸鼠胰腺癌动物模型,进一步通过整体动物水平来验证miR-216a在胰腺癌发病机制中的作用,为深入理解胰腺癌发病的分子机制及抗肿瘤效应奠定理论基础,从而为胰腺癌的早期诊断、分子靶向治疗提供新的依据和方法。方法：1、建立人胰腺癌PANC-1细胞的Balb/c裸鼠皮下移植瘤模型,共18只。2、当裸鼠胰腺癌皮下移植瘤体积生长至不低于50mm3时(V=ab2/2,计算肿瘤体积,a为长径、b为短径),随机分为3组：溶剂对照组(PBS)、阴性对照组(agomir NC及药物干预组(miR-216a agomir);在分组的第1天、4天、7天、10天分别瘤体注射对应的试剂,观察各组裸鼠体内瘤体生长速度及体积变化,用游标卡尺测量肿瘤的最长径及最短径,绘制肿瘤生长曲线。3、给予药物后的第13天采用颈椎脱臼法处死裸鼠后取出肿瘤,一部分组织中性福尔马林固定,用于免疫组织化学法(immunohistochemistry, IHC)检测裸鼠皮下移植瘤Ki-67及PCNA的表达观察肿瘤增殖情况;原位末端标记技术(TUNEL)检测移植瘤组织的细胞凋亡情况。其余组织液氮速冻,然后转移至-80-C冰箱保存做其余相关检测分析,采用实时定量PCR检测各组瘤体中miR-216a的含量,Western blot的方法检测移植瘤组织JAK2蛋白表达。4、数据采用SPSS13.0统计软件进行数据统计分析,所有数据以均数±标准差(x±s)表示,采用单因素方差分析或非参检验统计分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果1：裸鼠胰腺癌皮下移植瘤模型建立裸鼠在成瘤期间一般情况较好,皮下注射胰腺癌细胞2周后,裸鼠肿瘤体积均达到50mmm3以上,裸鼠胰腺癌皮下移植瘤模型构建成功。2：绘制肿瘤生长曲线根据实验结果绘制肿瘤生长曲线,发现三组都未完全抑制肿瘤增长,但与溶剂对照组和阴性对照组相比,干预组裸鼠皮下移植瘤生长缓慢,移植瘤体积明显缩小。干预组平均生长速度(162.28%±42.6%)VS溶剂对照组(362.86%±131.54%),差异显著(p=0.008)；干预组(162.28%±42.6%)VS阴性对照组(371.87%±141.14%)(p=0.006),差异也很显著；溶剂对照组VS阴性对照组(p=0.893),二者无明显差异。干预组实际增长体积为(89.76±15.82mnl3)VS溶剂对照组实际增长(209.77±61.26mmm3)及阴性对照组实际增长(208.50±76.86mmm3)干预组与阴性对照组、溶剂对照组相比差异具有统计学意义(P值分别为0.011、0.032,均小于0.05)；而阴性对照组与溶剂对照组相比无差异(p值为1.000,大于0.05)。各用药组均未发现裸鼠死亡。3：通过PCR(免疫荧光实时定量)测定各组PANC-1裸鼠皮下移植瘤组织中miRNA-216a所测含量干预组中miR-216a相对表达量(5029.43±226.03)与溶剂对照组(1.01±0.12)、阴性对照组(1.97±0.29)存在显著差异(P=0.000),而溶剂对照组与阴性对照组相比也存在明显差异(p=0.003),这可能与给药时阴性对照组注射miR-216a agomir中含有没有经过特殊修饰的miR-216a的片段有关。从结果我们可以初步判断,给予药物干预后,干预组中miR-216a的含量得到很大提高。4:Western blot检测各组移植瘤组织中JAK2蛋白表达水平干预组、溶剂对照组、阴性对照组中的JAK2平均相对灰度值分别为0.102±0.798VS0.739±0.211VS0.833±0.329；干预组与溶剂对照组、阴性对照组差异非常显著(p=0.001、0.006),而溶剂对照组与阴性对照组无明显差异(P=0.909,大于0.05),JAK2蛋白表达水平在干预组表达下降,进一步验证了在体内实验中miR-216a的提高抑制或阻碍了JAK2的表达,与前期我们的体外实验结果相一致。5：Ki-67及PCNA在裸鼠移植瘤组织中表达Ki-67在干预组与溶剂对照组、阴性对照组中的平均光密度值分别为0.2963±0.3048、0.4612±0.4687、0.4722±0.4662,采用单因素方差LSD检验结果可得出,干预组与溶剂对照组、阴性对照组差异非常显著(p=0.000、0.000),而溶剂对照组、阴性对照组无明显差异(P=0.645,大于0.05).再进一步从平均值可知；给予药物后,干预组Ki-67急剧降低,故表明miR-216a可通过影响Ki-67表达来调节细胞的增殖。PCNA在干预组与溶剂对照组、阴性对照组的平均光密度值分别为0.3502±0.0879、0.4358±0.0270、0.4460±0.0214；采用多个独立样本非参数检验,p=0.014,3组间有显著性差异,据平均秩次进一步推断,干预组平均光密度值最低,其次为溶剂对照组,最高为阴性对照组.因此,裸鼠移植瘤组织中注射miR-216a agomir后,PCNA的表达明显降低.说明干预组对PANC-1裸鼠胰腺癌细胞增殖影响可通过抑制PCNA的表达进而使肿瘤细胞生长减慢。6：细胞凋亡实验干预组与溶剂对照组、阴性对照组的光密度值分别为(0.7048±0.02481vs0.2247±0.04316vs0.2140±0.04853),进一步采用非参检验得知：P=0.003,说明3组间有显著性差异,再根据平均秩次可以认为干预组光密度值为最高,依次为溶剂对照组组,阴性对照组。TUNEL实验告诉我们,干预组给予miR-216a agomir后,使癌细胞的凋亡率增加,进一步验证了miR-216a在胰腺癌发展过程中起到的抑癌作用。结论：miR-216a agomir可促进移植瘤内miR-216a的表达,miR-216a可以下调胰腺癌PANC-1细胞裸鼠皮下移植瘤中JAK2基因的表达,使JAK2蛋白表达降低,进而抑制移植瘤的生长,并且还可以通过抑制移植瘤中Ki-67及PCNA的表达,诱导移植瘤细胞的凋亡.以miR-216a为早期胰腺癌肿瘤标志物和靶点的基因治疗有潜在临床应用前景。