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恶性肿瘤一直是严重危害人类健康的常见病和多发病。胃癌是人类癌症中死亡率居达第二位的恶性肿瘤。手术和放化疗结合是临床上治疗胃瘤的主要手段。然而,临床上胃癌常常产生耐药性,而且从一种药物的耐受会发展为对多种药物的交叉耐受,产生多药耐药性,最终导致化疗失败。肿瘤耐药产生的机制十分复杂,药物外排泵和多药耐药相关蛋白的过表达、药物靶点的突变、细胞修复功能的增强及细胞凋亡的减弱等都会导致肿瘤细胞的耐药。肿瘤细胞耐药的机制复杂,至今尚未完全阐明。研究显示,在包括胃癌在内的许多肿瘤中耐药发生可能是多种机制联合或者协同作用造成的。micro RNA (miRNA)是一类长约19～25nt的内源性非编码单链小RNA分子。miRNA广泛存在于动植物细胞中,它们可以结合到靶mRNA的3’-UTR序列上导致mRNA翻译的阻遏或者降解。miRNA与耐药关系密切,在耐药细胞和敏感细胞中miRNA表达谱存在显著差异,一些miRNA可调控相应的靶基因表达水平使肿瘤细胞产生耐药。钙蛋白酶(calpain)家族在哺乳动物中有16个蛋白成员,包括14个催化亚基成员和1个调节亚基成员及1个内源性的抑制、其他钙蛋白酶的家族成员。钙蛋白酶小亚基单位(calpain small submit1,CAPNS1)是调节钙蛋白酶家族成员calpain1和calpain2的调节亚单位。钙蛋白酶在肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁徙、分化、自噬等方面发挥重要功能。研究表明calpain家族成员可以直接参与半胱氨酸蛋白酶caspase家族成员的剪切,诱导细胞凋亡。顺铂(cisplatin,DDP)是临床上使用的肿瘤一线化疗药物,广泛应用于胃癌的术后辅助化疗。本研究在两株人胃癌细胞SGC-7901和BGC-823为亲本细胞株分别成功诱导出两株耐顺铂的胃癌细胞SGC-7901/DDP和BGC-823/DDP,并对两株耐药细胞的耐药指数和耐药表型进行鉴定的基础上,用miRNA表达谱芯片筛选出敏感细胞和耐药细胞两者差异表达的miRNA,同时用二维电泳—质谱分析筛选出两者差异表达蛋白,将两种芯片中的差异结果合并分析,再结合生物信息学比对分析,进而将预测结果经RT-PCR、Western blot、双荧光素酶报告基因等实验验证,发现了miR-99a与miR-491与CAPNS1在四种细胞内的上下游调控关系和它们共同作用对胃癌细胞耐药性产生影响,初步探讨了这种影响发生的机制,证实了CAPNS1调节的calpain1和calpain2可以通过对下游caspase3和PARP1的剪切影响胃癌的顺铂耐药。目的：利用高通量芯片技术在miRNA组学和蛋白组学水平筛选调控胃癌细胞耐药的miRNA与其靶基因,探讨其调节胃癌细胞顺铂耐药发生的机制,为在个体水平逆转耐药提供新的思路。方法：利用课题组已经诱导成功的两株耐顺铂的细胞株SGC-7901/DDP和BGC-823/DDP;采用Affymetrix公司miRNA2.0芯片对两对敏感和耐药细胞分别进行miRNA表达谱检测,cluster3.0进行聚类分析；二维电泳对两对细胞作差异蛋白筛查,根据差异的显现度对扫描凝胶后产生的差异蛋白挑出80个蛋白点进行质谱分析；在80个差异蛋白中用生物信息学网站MicroCosm Targets Version5结合miRNA表达谱芯片筛查并预测调控其表达差异的miRNA; RT-PCR验证芯片提示的差异miRNA的表达；双荧光素酶报告基因实验验证niRNA与靶基因3’-UTR的结合；miRNA模拟物与抑制剂分别转染两对细胞后平板克隆实验观察转染后在顺铂刺激下两对细胞单细胞成克隆的数目,免疫荧光实验检测转染后加入不同剂量顺铂刺激TUNEL阳性细胞数。Western blot检测在两对细胞中分别加入梯度剂量的顺铂刺激24h后钙蛋白酶家族成员CAPNS1, calpain1/2及caspase3, PARP1表达量的变化；HA-CAPNS1与si-CAPNS1高、低表达质粒分别转染耐药、敏感细胞后加入顺铂刺激观察下游基因caspase3、 PARP1表达变化；最后对高低表达的两种细胞再次进行平板克隆实验和免疫荧光实验验证转染miRNA模拟物与抑制剂产生的表型的实验结果。结果：1. miRNA表达谱芯片结果显示在SGC-7901与SGC-7901/DDP这一对细胞中表达差异倍数大于两倍的miRNA共计68条,其中耐药细胞上调表达的有41条,下调表达的有27条；在BGC-823与BGC-823/DDP这一对细胞中表达差异倍数大于两倍的miRNA共计94条,其中耐药细胞上调表达的有40条,下调表达的有54条。两对细胞中耐药细胞同时出现上调表达的miRNA有7条,下调表达的有6条。2.两对细胞二维电泳共筛选出2547个差异蛋白点,其中SGC-7901与SGC-7901/DDP存在1236个差异蛋白点,BGC-823与BGC-823/DDP存在1311个差异蛋白点。根据凝胶染色显现度挑出80个较显著的差异点进行质谱分析,得出77个表达差异点的NCBI蛋白GI编号。其中SGC-7901/DDP相对于SGC-7901高表达两倍以上的蛋白有16个,低表达两倍以上的有20个,BGC-823/DDP相对于BGC-823高表达两倍以上的有18个,低表达两倍以上的蛋白有23个。3. RT-PCR验证两对细胞株中共同上调和下调的miRNA发现miR-99a与miRNA-491同时在两株耐药细胞中较敏感细胞高表达,在SGC-7901/DDP中分别升高4.98±0.88倍(n=3,P<0.01)和2.60±0.92倍(n=3,P=0.07),在BGC-823/DDP中分别升高3.83±0.31倍(n=3,P<0.01)和2.16±0.96倍(n=3,P=0.18)。4. Western blot实验验证二维电泳—质谱结果,表明CAPNS1在两株耐药细胞中都较敏感细胞显著低表达,且CAPNS1低表达的同时其钙蛋白酶催化大亚基单位calpainl和calpain2也低表达；在敏感细胞中CAPNS1高表达的同时calpainl和calpain2表达量高于耐药细胞。5.利用生物信息学工具MicroCosm Targets Version5与：miRanda预测miR-99a和miR-491可能结合的靶基因,发现miR-99a与miR-491共同调控的靶基因中有CAPNS1,且两miRNA与CAPNS1的3’-UTR结合区域有重叠,而CAPNS1正是我们在二维电泳—质谱实验中筛选到并经Western blot验证的差异表达蛋白之一。6.双荧光素酶报告基因实验证实miR-99a与miR-491与CAPNS1的3’-UTR结合,而突变二者共同结合区域将导致miRNA不能与3’-UTR区域结合。7.在敏感细胞中分别高表达miR-99a与miR-491都会使其靶基因CAPNS1表达量升高；在耐药细胞中分别低表达miR-99a与miR-491都会使其靶基因CAPNS1表达量降低。在两类细胞中联合高低表达两miRNA无竞争性地减弱对CAPNS1的调控,同时也无明显的增强作用。8.克隆实验证实,在敏感细胞中高表达miR-99a和miR-491后用顺铂处理细胞,其单细胞成克隆能力增强；在耐药细胞中低表达miR-99a和miR--491后用顺铂处理细胞,其单细胞成克隆能力减弱。同样,在敏感细胞中低表达两miRNA的靶基因CAPNS1后用顺铂处理单细胞成克隆能力增强；在耐药细胞中高表达CAPNS1后用顺铂处理单细胞成克隆能力减弱。9.免疫荧光实验证实在敏感细胞中低表达miR-99a和miR-491后用顺铂处理TUNEL阳性细胞数量减少；在耐药细胞中高表达miR-99a和miR-491后用顺铂处理TUNEL阳性细胞数量增加。同样,在靶基因CAPNS1水平上,敏感细胞干涉CAPNS1表达后顺铂处理TUNEL阳性细胞减少；耐药细胞高表达CAPNS1后顺铂处理TUNEL阳性细胞增多。10.在不同剂量的顺铂处理24h后四种细胞的CAPNS1表达量随顺铂剂量的增高而增加,同时其大亚基单位calpain1/2表达量增加,直接剪切其靶分子caspase3, caspase3继续剪切凋亡效应分子PARP1,致剪切体表达增多。在敏感细胞中低表达CAPNS1后用顺铂处理可以降低calpain1/2的表达,抑制caspase3和PARP1剪切体的形成,而在耐药细胞中高表达CAPNS1后用顺铂处理可以升高calpain1/2的表达,促进caspase3和PARP1剪切体的形成。结论：miR-99a、miR-491和CAPNS1在敏感与耐药细胞中存在表达差异,并且两miRNA与CAPNS1之间有直接的调控关系,但两者对CAPNS1的调控并无明显的竞争或协同关系。miRNA-CAPNS1-calpainl/2-caspase3-PARP1之间精密的调控关系影响了胃癌细胞的顺铂耐药。本研究首次明确了miR-99a与miR-491对CAPNS1调控这一机制对胃癌细胞顺铂耐药的影响,明确了钙蛋白酶家族成员在胃癌耐药中的作用,扩充了胃癌耐药的新机制,增加了对miRNA与肿瘤耐药之间的新认识,也为临床筛查和干预肿瘤耐药提供了潜在的新靶点。