论文部分内容阅读
目的:PGC-1α（peroxisome proliferator-activated receptor-γcoactivator-1α）是过氧化物酶体增殖物激活受体γ的转录辅助活化因子之一,主要参与线粒体生物合成的调节,在机体能量代谢和组织衰老过程中扮演着重要的角色。腹主动脉瘤（abdominal aortic aneurysm AAA）是指发生在腹主动脉处局部血管管壁的扩张或膨出,通常指瘤体直径超过正常直径的1.5倍。目前关于线粒体损伤和血管衰老导致AAA形成与发展的研究较少,因此,本研究拟通过猪胰弹性蛋白酶（porcine pancreatic elastase PPE）诱导PGC-1α血管平滑肌细胞条件性敲除小鼠构建AAA模型,旨在探讨PGC-1α通过线粒体损伤和血管衰老两方面促进AAA形成的机制,以期为临床AAA诊疗提供新方向。方法:1.PGC-1αf/f.Tagln-Cre+/-和PGC-1αf/f.Tagln-Cre-/-小鼠的繁殖与鉴定先使用PGC-1αf/f.Tagln-Cre-/-和PGC-1α+/+.Tagln-Cre+/-小鼠进行配种繁殖。子代小鼠3周左右时分笼,剪取鼠爪,提取基因组DNA进行基因鉴定,筛选出PGC-1αf/+.Tagln-Cre+/-子代小鼠。然后将PGC-1αf/+.Tagln-Cre+/-与亲代PGC-1αf/f.Tagln-Cre-/-繁殖,以同样基因鉴定方法,筛选出PGC-1αf/f.Tagln-Cre+/-目的基因小鼠。最后将目的基因小鼠再与PGC-1αf/f.Tagln-Cre-/-小鼠繁殖,筛选出PGC-1αf/f.Tagln-Cre+/-（PV-KO）小鼠作为基因敲除组,PGC-1αf/f.Tagln-Cre-/-（PV-WT）小鼠作为基因未敲除组,饲养至10～14周,用于后续实验。2.C57BL/6N小鼠AAA模型的构建和组织处理选取10-14周的年轻小鼠和18-24个月的老龄小鼠,麻醉、脱毛后固定于手术台。开腹后用棉签分离覆盖于腹主动脉上的筋膜和脂肪组织,用电子视频显微镜测量各组小鼠腹主动脉外径最大值作为术前直径。以20ul PPE浸润明胶海绵外敷腹主动脉五分钟建立AAA动物模型实验组,以20ul无菌生理盐水同样方法浸润明胶海绵外敷腹主动脉五分钟建立模型对照组。术后均用无菌生理盐水清洗腹腔后关腹。正常饮食,第14天腹主动脉组织取材。统计这14天期间小鼠死亡情况,并作生存曲线分析。使用电子视频显微镜测量各组小鼠腹主动脉外径最大值作为术后直径,并对术前术后直径进行统计学分析。利用western blot技术检测小鼠腹主动脉组织PGC-1α、MFN2、SIRT3、P21等蛋白表达水平。HE及EVG等染色技术观察小鼠腹主动脉血管形态、管壁厚度及弹力纤维断裂降解情况,并进行半定量分析。3.基因小鼠AAA模型的构建和组织处理选取同批次10～14周的PV-WT和PV-KO小鼠,麻醉、脱毛后固定于手术台。开腹后用棉签分离覆盖于腹主动脉上的筋膜和脂肪组织,用电子视频显微镜测量各组小鼠腹主动脉外径最大值作为术前直径。以20ul PPE浸润明胶海绵外敷腹主动脉五分钟建立AAA动物模型实验组,以20ul无菌生理盐水同样方法浸润明胶海绵外敷腹主动脉五分钟建立模型对照组。术后均用无菌生理盐水清洗腹腔后关腹。正常饮食,第14天腹主动脉组织取材。统计这14天期间小鼠死亡情况,并作生存曲线分析。使用电子视频显微镜测量各组小鼠腹主动脉外径最大值作为术后直径,并对术前术后直径进行统计学分析。利用western blot技术检测小鼠腹主动脉组织PGC-1α、MFN2、SIRT3、AMPK、P53、P21等蛋白表达水平。免疫组织化学检测小鼠腹主动脉组织PGC-1α的表达情况。HE及EVG等染色技术观察小鼠腹主动脉血管形态、管壁厚度及弹力纤维断裂降解情况,并进行半定量分析。4.统计方法小鼠生存曲线采用对数秩检验（log-rank Mantel-cox text）,小鼠成瘤率采用卡方检验中的Fisher’s确切概率法,其余数据组间多重比较采用单因素方差分析加Bonferroni事后检验。本研究所有统计学分析中,*P＜0.05代表差异有统计学意义,并采用均数±标准误（X±SEM）描述实验数据,以SPSS 26.0作为统计学分析软件,以Graph Pad prism 8.0为作图软件。结果:1.PPE外敷小鼠腹主动脉可显著导致AAA的形成。2.PPE可导致腹主动脉弹力纤维降解及管壁结构损伤,且C57老龄小鼠比年轻小鼠损伤更严重。3.相比于年轻C57小鼠,老龄C57小鼠在PPE和saline的作用下PGC-1α在腹主动脉组织中均表达下调。4.老龄小鼠线粒体关键调节蛋白SIRT3和MFN2在PPE诱导的C57小鼠腹主动脉组织中表达低于年轻小鼠。5.衰老标志物P21在C57小鼠PPE实验组中表达高于saline对照组。6.线粒体及相关代谢功能指标在PPE的作用下,MFN2和AMPK表达在PV-WT组要低于PV-KO组,而SIRT3则与之相反。7.在PPE实验组中,PV-KO组相关衰老标志物P53和P21的表达高于PV-WT组。8.在PPE的作用下,PV-KO组的腹主动脉弹力纤维降解及管壁结构损伤比PV-WT组严重。结论:小鼠血管平滑肌细胞PGC-1α的缺失,在PPE的诱导下,通过线粒体损伤和血管衰老,将促进AAA的形成。